细菌染色技术
(2010-11-22 22:29:46)
目的要求
初步掌握细菌涂片制作，单染色法及革兰染色法等染色技术。
实验内容
1．细菌染色一般程序
涂片干燥固定初染 (媒染) 脱色复染
(1) 涂片临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。
(2)干燥涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。
(3)固定细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3～5次，温度以手能摸时热而不烫为度。目的在于杀死细菌，凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。
(4) 初染不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆盖菌膜为度。
(5) 媒染通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。
(6) 脱色此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。
(7) 复染细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观察。复染液的颜色与初染液有明显不同。
2．常用染料原液配制
一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量：美兰2g～5g；结晶紫7g～14g；碱性复红3g～7g。
3．常用的染色方法
(1) 单染色法即用一种染料染色的方法。常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。
1) 染液
①吕氏美兰液美兰酒精饱和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成。
②稀释石炭酸复红液碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸馏水作10倍稀释即成。
2) 菌种大肠埃希菌普通斜面培养物。
3) 染色方法于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染色1min，以水冲洗至无颜色流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。
4) 结果以美兰染色者菌体呈现兰色；以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色。
(2)革兰染色法
1) 原理细菌被结晶紫着色后，再经媒染剂处理，染成深紫色或紫黑色。如被酒精脱去颜色，经复红复染成红色，称为革兰阴性菌；如不被酒精脱色，则仍为紫黑色，称为革兰阳性菌。
革兰染色的原理尚未完全明了，主要有三种学说：①等电点学说革兰阳性菌的等电点低(pH2～3)，革兰阴性菌等电点较高(pH4～5)，一般染色液pH值
为7.0左右，故电离后阳性菌所带阴电荷比阴性菌多，因此，摄取带阳电荷的染料（如结晶紫）多且不易脱色。②通透性学说革兰阳性菌细胞壁的通透性比阴性菌小，脱色剂较易通过革兰阴性菌的细胞壁，将染料溶解洗出，故易脱色；阳性菌的细胞壁通透性低，故不易脱色。③化学学说革兰阳性菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它能和染料-媒染剂互相结合，使已着色的细菌不易脱色；革兰阴性菌体含核糖核酸镁盐复合物较少，易被脱色。
2) 染液
①结晶紫染液取结晶紫饱和溶液20ml+1%草酸铵水溶液80ml混合过滤。
②卢戈碘液取碘化钾2ml以10ml蒸馏水充分溶解，然后加碘1g待完全溶解后加蒸馏水至300ml。
③脱色剂 95%乙醇。
④稀释石炭酸复红同单染色法。
3) 菌种大肠埃希菌和葡萄球菌混合菌液。
4) 方法
①初染将结晶紫染液2～3滴加于制好的涂片上，染色 1min，水洗；
②媒染加卢氏碘液2～3滴染色1min，水洗；
③脱色 95%乙醇脱色0.5min(无紫色脱落为止)，水洗；
④复染加稀释石炭酸复红数滴，染色1min，水洗干后镜检。
5) 结果革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌染成红色。
6) 注意事项①涂片不宜过厚，否则脱色受影响，使革兰阴性菌染成革兰阳性菌，造成错误鉴定。②为防止染液蒸发而改变浓度，碘液的颜色变淡应弃去。
③涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果，故每次水洗后应将玻片甩干。
④注意细菌的菌龄，一般以18h～24h左右培养物效果最好，菌龄过长影响细菌染色性。
(3) 萋-纳抗酸染色法(ziehl—neelsen)：主要用于结核杆菌和麻风杆菌检查。
1) 染液
①石炭酸复红染液取碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸水溶液90ml 混合。
②脱色剂 3%盐酸酒精。
③复染剂吕氏美兰染液，同单染色法。
2) 菌种卡介苗和表皮葡萄球菌混合液。
3) 方法
①初染在已固定的涂片上滴加石炭酸复红染液，远火徐徐加热至有蒸汽冒出，但切不可沸腾，并随时添加染色液，染色3 min～5min，冷却后水洗。
②脱色滴加3%盐酸酒精脱色至无红色流下为止，一般为2min。
③复染水洗后用吕氏美兰复染0.5 min～1min，水洗干后镜检。
4) 结果抗酸菌染成红色，非抗酸菌染成蓝色。
5) 注意事项①加热时火切勿过大，防止染液沸腾。②每张玻片只允许放一份标本，以免阴阳结果混淆。③用过的玻片要彻底洗干净，防止抗酸菌留在玻片上。④切勿使用染色缸，印干的滤纸只能一片一张，不得重复使用。⑤脱色时间宁长勿短，以免误诊。⑥为防止实验室感染，标本要高压灭菌后再制片。
(4) 潘本汉抗酸染色法(panpenhein) 主要用于尿及粪便中抗酸菌检查。
当用萋-纳抗酸染色检出抗酸菌后，用该方法染色，结核分枝杆菌染成红色，耻垢分枝杆菌染成蓝色。
1) 染液
①石炭酸复红染液见萋-纳抗酸染色法。
②复染液取蔷薇色酸1g先溶于100ml无水乙醇中，然后加美兰2g(至饱和)，置室温中4天，使其充分溶解，过滤后加甘油20ml混匀备用。
2) 标本怀疑肾结核患者的尿液。
3) 方法
①初染于制好的涂片上滴加石炭酸复红染液数滴加温染色2min。
②复染倾去染液勿水洗，滴加复染液，边滴边倾去，重复4～5次后，水洗、待干、镜检。
3) 结果结核分枝杆菌染成红色，耻垢分枝杆菌及其他细菌染成蓝色。 (5) 鞭毛镀银染色法
1) 染液
①甲液鞭酸5g，三氯化铁5g，36%甲醛1ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100ml。
②乙液取AgNO3 2g溶于100ml蒸馏水中，临用前用15%氨水滴定，出现棕色沉淀后继续滴加氨水直至呈现乳白色薄雾状为止。
2) 方法
①将奇异变形杆菌在1.4%的软琼脂上传两代，形成迁徙生长现象。取洁净玻片一张，于玻片上滴加蒸馏水一滴，然后取上述迁徙生长边缘的细菌少许，轻轻点于蒸馏水中，使其自然扩散、干燥，切勿火焰固定。
②在制好的涂片上滴加甲液染3 min～5min，用蒸馏水冲洗。
③用乙液冲去残水后，加乙液0.5 min～1min，并在火焰上方稍加热，用蒸馏水冲洗，干后镜检。
3) 结果菌体染成深褐色，鞭毛染成浅褐色。
4) 注意事项①细菌培养时传代次数因菌种不同可适当增加。②制涂片时菌量不宜过多，动作要轻，切勿研磨，以免鞭毛脱落。③加乙液后加热温度不要太高。
(6) 魏曦氏鞭毛染色法
1) 染液饱和钾明矾液2ml，5%石炭酸液5ml，20%鞣酸液2ml相混合。临用时加碱性复红酒精饱和液1ml，混合后过夜，次日过滤后使用。此染液以3日内使用效果最好。
2) 方法将奇异变形杆菌在 1.4%的软琼脂上传两代，形成迁徙生长现象。取高度洁净玻片一张，于玻片上滴加蒸馏水一滴，然后取上述迁徙生长边缘的细菌少许，轻轻点于蒸馏水中，使其自然扩散，置37℃培养箱内让其自干。无需火焰固定。滴加染液染0.5 min～1min，水洗待干，镜检。
3) 结果菌体与鞭毛均呈红色。
(7) 芽胞染色法
1) 染液
①石炭酸复红染液见抗酸染色法。
②脱色剂 95%乙醇。
③复染液吕氏美兰染液，同单染色法。
2) 菌种炭疽芽胞杆菌普通斜面培养物。
3) 方法
①初染于制好的涂片上滴加石炭酸复红染液加热染3 min～5min，勿使染液沸腾。
②脱色水洗后用95%乙醇脱色约1min，水洗。
③复染加吕氏美兰染液染1min，水洗干后镜检。
4) 结果芽胞染成红色，菌体呈蓝色。
(8) 黑斯(Hiss)荚膜染色法
1) 染液结晶紫染液：取结晶紫饱和液5ml加蒸馏水95ml混合；20%CuSO4水溶液。
2) 标本提前数日小白鼠腹腔注射肺炎链球菌菌液0.2ml，小鼠死亡后解剖取腹腔液印片。
3) 方法
①将印片在空气中自然干燥，无需加热固定。
②滴加结晶紫染液在火焰上加热，使有蒸汽冒出为止，勿水洗。
③以20% CuSO4溶液冲洗染液，勿水洗，干后镜检。
4) 结果菌体呈紫色，荚膜呈淡紫色。
(9) 阿尔伯特(Albert)异染颗粒染色法
1) 染液
①甲液甲苯胺兰0.15g，孔雀绿0.2g，溶于95%酒精2ml中再加入蒸馏水至100ml及冰醋酸1ml，放置24h后过滤备用。
②乙液将碘化钾3g溶于蒸馏水10ml～20ml中，再加碘2g等溶解后加蒸馏水至300ml备用。
2) 菌种白喉棒状杆菌吕氏鸡蛋斜面培养物。
3) 方法已固定的涂片上加甲液染3 min～5min，水洗后，再加乙液染色1min，水洗待干，镜检。
4) 结果菌体呈蓝绿色，异染颗粒呈蓝黑色。
(10) 刚果红染色法(负染色法)：背景着色而菌体不着色的染色方法。
1) 染液 2%刚果红水溶液，1%盐酸酒精溶液。
2) 方法于载玻片上滴加2%刚果红溶液1滴与少量培养菌混合，涂成均匀厚片待干，以1%盐酸酒精溶液冲洗，待干后镜检。
3) 结果背景呈蓝色，菌体无色。
(11) 金胺“O”染色法
1) 染液
①金胺“O”染液金胺“O”0.1g溶于10ml95%酒精中，另取3ml石炭酸加在87ml的蒸馏水中。将此二液混匀，虽混浊但不必过滤，装入褐色瓶中，放室温保存。
②0.5%盐酸酒精。
③0.5%高锰酸钾溶液。
2) 菌种怀疑结核的痰标本。
3) 方法在已固定的涂片上加金胺“O”染液染15min，水洗后用0.5%盐酸酒精脱色2min，水洗，再加0.5%高锰酸钾液作用3min，水洗，待干，用荧光显微镜观察。
4) 结果抗酸菌呈亮黄色荧光。
（12）美兰染色法
美蓝是常用的活体染色染料，当它处于氧化状态是呈现出蓝色，而还原态时为无色。用它进
行活体染色时，由于活细胞代谢过程中的脱氢作用，美蓝接受H后就由氧化转变为还原态，故表现出无色；而衰老的细胞由于代谢缓慢或停止，不能使美蓝还原，所以呈蓝色或者淡蓝色。
（13）苏木精-伊红染色
苏木精-伊红染色，又称“苏木素-伊红染色”，或“H&E染色”（hematoxylin and eosin stain、HE stain），是组织学最常用的染色方法之一。
这种染色方法的基础是组织结构对不同染料的结合程度不同。染料苏木精可以将嗜碱性结构染成蓝紫色，而伊红可以将嗜酸性结构染成粉红色。嗜碱性结构通常包括含有核酸的部分，如核糖体、细胞核及细胞质中富含核糖核酸（RNA）的区域等。嗜酸性结构则通常由细胞内及细胞间的蛋白质，如路易体（Lewy body）、酒精小体（Mallory body）、细胞质的大部分等。有时，黄褐色也会出现在染色样本中，这是由于组织内原有的色素，例如黑色素等造成的。（14）吉姆萨染液
吉姆萨染液（英语：Giemsa stain）是一种用于染色体的染色方法。它是罗曼诺夫斯基染色法的改进版本。以它的发明者，德国汉堡科学家古斯塔夫·吉姆沙命名。染色物质Giemsa 与DNA上的磷酸机团结合，可以用于产生G显带并制作染色体组型图。通过后者，可以观察到染色体变异，如缺失，易位等。
Giemsa在A-T丰富的区段结合率高，通过显微镜可以观察到该区段呈暗带。
（15）免疫组织化学
免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。
免疫组织化学的优势在于专一性、灵敏度、简便快速以及成本低廉，所以广为医院采用，通常是借由特定的肿瘤标记来筛选癌症。免疫组织化学染色法对基础研究及预防和诊疗上都是相当重要的一个方法。
（16）刘氏染色法
刘氏染色法（Liu's stain），一种将动物细胞染色以便用光学显微镜观察的方法。改良自瑞氏染色法（Romanowsky Stain），1953年由台湾大学刘祯辉教授所研究发表。
简介
相较于其他染色法，刘氏染色法的优点是非常快速，染色过程只须2~3分钟。刘氏染色法在临床上的应用非常广泛，主要用作血球染色形态分类，此外也可以当作组织学的简易染色，在临床细菌学上的使用更可以作为阴道分泌物、痰液、脓等检体的简单染色剂(Simple Stain)。成份
刘氏染色法所用的染液分成LiuA和LiuB两部份。LiuA含有Eosin Y，可将细胞质和血红素等染成红色；LiuB则含有Azur I 和methylene azure，可和细胞核以及白血球的嗜碱性颗粒作用，染成蓝紫色。
染液
LiuA Eosin Y 甲醇（用来固定细胞）methylene azure（少量）
LiuB Azur I methylene azure Na2HPO4˙12H2O 水KH2PO4
步骤
将组织切片放到玻片上风干固定
将Liu A染液滴加在已固定的玻片上，静置30~45秒
直接再加上Liu B染液（大约两倍Liu A体积的量），吹气混合，静置60~90秒
用小水流冲洗玻片背面，洗去残余染液，可看到表面出现绿色金属光泽
风干后即可到显微镜下观察
实验二细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察 1. 目的要求 （1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。 （2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。 （3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 2. 基本原理 （1）简单染色法 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观 察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 （2）革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为 两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类
物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现 红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革 兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或 附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。 脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱 色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不 同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色 的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 3. 材料及器材 (1) 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 (2) 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等 4. 方法与步骤 Ⅰ涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 Ⅱ干燥室温自然干燥。 Ⅲ固定固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
第31卷第2期2010年3月西安交通大学学报(医学版) J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Scie nces )V ol.31No.2Mar.2010 ◇技术方法◇ 核受体免疫组织化学染色时抗原修复方法的选择 张富军,任 娟,王飞苗,吕社民,李冬民 (西安交通大学医学院遗传学与分子生物学系,陕西西安 710061) 摘要:目的 探讨不同抗原修复法对DA.1U 大鼠肝组织内核受体检测结果的影响。方法 应用微波修复法、高压修复法、酶修复法和高压加酶修复法对DA.1U 大鼠肝组织切片进行修复,然后进行免疫组化染色。结果 DA.1U 大鼠肝组织内核受体L XR 2α、L XR 2β、PPAR 2γ和FXR 经高压抗原修复后,染色阳性强度较其他修复方法明显增强,而且定位较佳。结论 在核受体免疫组化染色中高压抗原修复法染色效果优于其他抗原修复法。关键词:核受体;免疫组织化学;抗原修复 中图分类号:R329233 文献标志码:A 文章编号:167128259(2010)022******* Selection of antigen retrieval methods in immunohistochemical staining of nuclear receptors ZHAN G Fu 2jun ,REN J uan ,WAN G Fei 2miao ,L ΒShe 2min ,L I Dong 2min (Depart ment of Genetics and Molecular Biology ,Medical School of Xi πan Jiaotong University ,Xi πan 710061,China ) ABSTRACT :Objective To explore t he eff ects of diff ere nt met hods of antige n ret rieval on t he results of immunohist ochemical staining of nuclear recep t ors. Methods A ntige ns were ret rieved by using microwave oven , aut oclave ,e nzyme and aut oclave plus e nzyme ,respectively ,in liver sections f rom DA.1U rats ,f ollowed by immunohist ochemical staining. Results Af ter a ntige n ret rieval wit h aut oclave ,t he p ositive staining inte nsity of nuclear recep t ors L XR 2 α,L XR 2β,PPAR 2γa nd F XR in t he liver sections f rom DA.1U rats was enhanced obviously ,a nd t he location of nuclear recep t ors was better by using t his met hod t han t he ot hers. Conclusion In t he immunohist ochemical staining of nuclear recep t ors ,using aut oclave t o ret rieve a ntige ns is t he best met hod. KE Y WOR DS :nuclear recep t or ;immunohist oche mical staining ;a ntige n ret rieval 收稿日期:2009202224 修回日期:2009203229 基金项目:国家自然科学基金(No.30400249,30571725,30630058); 陕西省国际合作项目(No.20072kw 206);陕西省自然科学基金项目(No.2004C256) Supported by t he National Natural Science Foundation of China (No.30400249,30571725,and 30630058),Interna 2tional Cooperation Foundation of Shaanxi Province (No.20072kw 206)and t he Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2004C256). 通讯作者:李冬民.E 2mail :lidongm @https://www.doczj.com/doc/8118261617.html, 作者简介:张富军(19632),男(汉族),实验师. E 2mail :zfj @https://www.doczj.com/doc/8118261617.html, 核受体在生物体内广泛分布,与配体结合后活化,调控基因的表达,在机体生长发育、新陈代谢等生 理过程中发挥重要作用。核受体L XR 2α、L XR 2 β、PPAR 2γ和FXR 在糖、脂代谢调控中起重要的作用,参与2型糖尿病的发生发展。 免疫组织化学染色是根据抗原与抗体特异性结合的原理,用标记的特异抗体对组织细胞内抗原进行定位、定性及定量研究。甲醛溶液固定导致许多抗原决定簇被掩盖,不能与抗体很好结合。核受体位于核 内,镜下观察染色结果时,若隐若现,抗原表达不均匀。为了解决该问题,使抗原决定簇能很好的暴露出来,我们采取了微波修复法、高压热修复法和酶修复法等。抗原修复方法对DA.1U 大鼠肝组织切片进行修复;比较分析不同抗原修复法对DA.1U 大鼠肝组织内核受体免疫组化染色结果的影响。1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 Olymp us DP71图像分析仪。 L XR 2α、L XR 2β、PPAR 2γ和FXR 抗体购自Abcam 公司;免疫组化(SP 法)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。 1.2 组织材料 病理切片来自DA.1U 大鼠糖尿病 模型肝组织,经40g/L 多聚甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,5μm 厚,每个蜡块各切5片。 1.3 抗原修复 组织切片常规脱蜡至水,3%(体积 分数)H 2O 2灭活内源性过氧化物酶,0.02mol/L
细菌的常用染色技术 简单染色法：利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。例如番红。 1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。 2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。 3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。 4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。 6．干燥 7．镜检 复染色：利用用两种以上染料对细菌进行染色。例如革兰氏染色法。 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，需要碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。 碱性染料初染液的象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为番红。 1.载玻片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。 2.草酸铵结晶紫染1分钟。 3.自来水冲洗，去掉浮色。 4.用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。 5.用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。 6.用番红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。
（４）８５％最终为均质性强化。这些特点与肺癌的新生小血管多及其结构特点有关，与肿瘤的组织代谢旺盛有关，是肺癌诊断强有力的特征［２～４］。本文恶性病变强化方式与文献报道［５，６］一致。而良性病变增强幅度小，一般小于２０ＨＵ，炎性肿块则强化明显，常大于６０ＨＵ。 孤立性肺内结节常见疾病主要有周围型肺癌、孤立性肺转移瘤、结核瘤及纤维干酪结节、球形肺炎、机化性肺炎、肺部真菌感染、错构瘤、肺炎性假瘤、肺部其他良性肿瘤等。薄层ＣＴ及增强检查同时结合多平面重建技术基本可鉴别良恶性结节；对诊断确有困难者可行ＣＴ导引下病灶穿刺活检，或应用新的ＭＲ成像技术（包括ＤＷＩ以及ＰＷＩ等不仅能反映肺部良恶性结节的形态学特点，还可以反映出更多功能学信息）［７，８］，将会对良、恶性肺结节认识的不断加深，大大提高了对肺内孤立性结节的鉴别诊断，为临床诊治提供了必要的信息。 参考文献 ［１］ 李惠民，肖湘生．肺结节ＣＴ影像评价〔Ｊ〕．中国医学计算机成像杂志，２００１，７（１）：３０－４１．［２］ 张敏鸣，周华，邹煜．动态增强ＣＴ对孤立性肺结节的定量研究〔Ｊ〕．中华放射学杂志，２００４，３８（３）：２６３－２６７． ［３］ 李相生，肖湘生．孤立性肺结节的ＣＴ增强特点及其血供病理学基础〔Ｊ〕．临床放射学杂志，２０００，１９（１１）：７３０－７３１． ［４］ 滕皋军，蔡锡类，高广如，等．支气管肺癌的双重供血〔Ｊ〕．中华放射学杂志，１９９１，２５（２）：８０． ［５］ 滑炎卿，郑向鹏，张国桢．孤立性肺结节的增强ＣＴ表现及鉴别诊断〔Ｊ〕．上海医学影像，２０００，９（２）：６７－７０． ［６］ 范国华，陆之安，龚建平，等．孤立性肺结节增强扫描ＣＴ值的探讨〔Ｊ〕．实用放射学杂志，２００２，１８（６）：４５９－４６１． ［７］ Ｎｏｍｏｒｉ Ｈ，Ｍｏｒｉ Ｔ，Ｉｋｅｄａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ－ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｐｌａｃｅ ｏｆ ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ Ｎ ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｆｅ－ｗｅｒ ｆａｌｓｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ〔Ｊ〕．Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ，２００８，１３５（４）：８１６－８２２． ［８］ 李伟栋，李东，刘海东，等．３．０ＴＭＲ扩散加权成像对肺实性良恶性病变的鉴别诊断效能及ｂ值优化探讨〔Ｊ〕．中国肺癌杂志，２０１１，１４（１１）：８５３－８５７． 收稿日期２０１３－０１－１０ （编辑 落落） 三种常用细菌染色法的改良 蒋莲秀 黄光玲 吴 丹 何 义 钟毓娟 桂林医学院基础医学院实验教学中心，广西桂林市 ５４１００４ 摘要 微生物中常用的细菌染色方法有多种，其中荚膜染色、鞭毛染色、抗酸染色等染色方法操作较为复杂，不易掌握。本文参考有关文献报道，结合教学经验，对上述三种染色方法上加以改进，实验结果显示改进后不仅操作简便，且染色效果较好。 关键词 荚膜染色 鞭毛染色 抗酸染色 中图分类号：Ｒ３３ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００１－７５８５（２０１３）０８－１０６８－０２ 细菌属于原核细胞型微生物，其营养、代谢及繁殖都与其细胞结构有关，因此了解细菌的细胞形态结构十分重要，细菌个体小，无色半透明，不染色在镜下不易于观察，经染色后的细菌细胞结构与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。细菌及其特殊结构的染色方法主要有革兰染色、抗酸染色、鞭毛染色、荚膜染色及芽孢染色法等。多年来上述染色方法已经过多次改进，但仍存在操作繁琐、不易掌握、染色效果不理想等缺点。现介绍几种改良方法及注意事项。 １ 荚膜染色 荚膜是某些细菌的特殊结构，具有黏附、抗吞噬作用，与细菌的致病性有关，在细菌的鉴定中有重要意义。荚膜的形成主要受遗传因素决定，但也与环境条件有关，一般在动物体内和营养丰富（含大量血清和糖）的培养基中容易形成，而在普通培养基上易消失［１］。细菌的荚膜染色在微生物学教学实验和某些细菌学诊断中是一种常用的也是较难掌握的一种染色技术。目前常用的染色法有Ｈｉｓｓ、Ｍｕｉｒ，Ｏｌｔ、湿（干）墨水负染法以及改良染色法等，但这些方法仍然存在染色效果不理想等缺点。在传统的染色技术的基础上经过多次实验，探讨建立了一种新的肺炎球菌荚膜染色法。 １．１ 材料和方法１．１．１ 标本。肺炎链球菌（小鼠腹腔液）涂片。 １．１．２ 染色液。Ａ液（鞭毛染色液）：甲液为５％石炭酸５份，２０％饱和钾明矾溶液２份，２０％鞣酸２份混合，乙液为碱性复红酒精饱和液１份，甲乙两液混合过滤第３天使用。Ｂ：碘液（革兰染色第２液）；Ｃ液：２０％甲醇；Ｄ液：乳酸酚棉兰。１．１．３ 染色方法。涂片先滴加Ａ液６０℃水蒸气蒸染（６０℃水浴箱）５ｍｉｎ，水洗，Ｂ液作用５ｍｉｎ，水洗，Ｃ液作用３０ｓ，水洗，Ｄ液复染２～５ｍｉｎ，水洗，干燥，油镜观察。 １．２ 结果 肺炎链球菌菌体染成紫红色，菌体外为一无色透明荚膜区，背景浅蓝或浅红（因染色时间不一而不同），菌体、背景、荚膜对比非常明显。 １．３ 注意事项 （１）肺炎链球菌的荚膜在动物体内及含有大量糖和血清的培养基中易形成，因此为使荚膜肥厚，在动物体内宜多传代几次，每次传代时在濒死的动物体内注射荚膜保护液后，再无菌抽取腹腔液注射至健康的小白鼠体内，效果较好（另文详细报道）。（２）石炭酸浓度不能过高，否则荚膜染色效果更差［２］；乳酸酚棉兰放置时间越长染色效果越好，新配置乳酸酚棉兰染色液需放置３７℃培养箱一定时间效果较佳；鞭毛染色液配置时间不宜太长，以１周以内使用效果较好。 ８６０１
做好免疫组化染色必须注意的问题 一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。 在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。 二、组织脱水必须彻底干净 组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。 三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折 应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。 四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。 免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。 五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。 应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此，
简单染色 微生物染色原理 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。 常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 使用草酸铵结晶紫染色液，染色迅速，着色深，菌体呈紫色。 步骤 1、涂片 1.取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央滴一小滴生理盐水； 2.用接种环无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌苔； 3.将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。 注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 2、干燥 将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然干燥。也可用电吹风低温吹干。 3、固定 手持(木夹夹住)已干燥的涂有菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次。 原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。 4、染色 将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 染色时间：吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红染色约1min；草酸铵结晶紫染色约1min。 5、水洗 将细菌涂片上染液倒入废液缸中；手持细菌染色涂片，置于废液缸上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。 6、干燥 自然干燥：平放于室温，自然干燥； 吹干：用电吹风冷风或低温热风吹干； 吸干：平放在一张吸水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。 配方 1、吕氏碱性美蓝染液 溶液A 美蓝0.6克；95%乙醇30毫升 溶液B 氢氧化钾0.01克；蒸馏水100毫升 分别配制溶液A和B 配好后混合即可。
实验三细菌的简单染色与形态观察 一、目的要求： 1.了解并掌握细菌简单染色的机理及技术； 2.学会用油镜观察细菌细胞的形态。 二、实验材料： 1.菌种：枯草杆菌Bacillus subtilis、大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌StapHyloccus aureus等培养好的细菌斜面； 2.染料：结晶紫 3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸。 三、基本原理： 染色是细菌学上一个重要而基本的操作技术。因细菌细胞小而且透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及其细胞结构。 用于微生物染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够成盐的性质。染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝、结晶紫、碱性复红、沙黄、孔雀绿等都属于碱性染料。 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性和弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料电离后带有正电荷，很容易与菌体结合使细菌着色。 通过本实验，学习和掌握细菌的染色技术，了解细菌细胞的形态，巩固课堂知识，增加感性认识。 四、方法与步骤： （一）制片 1.涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从枯草芽孢杆菌 斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜，涂布面积约1~1.5cm2。 2.干燥：室温自然干燥 3.固定：手执载玻片一端，使涂菌一面向上，通过火焰2~3次。此操作也称热固定，其目 的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在玻片上。 4.染色：将涂片置于水平位置，滴加结晶紫染色液（以刚好覆盖涂片薄膜为宜），染色1min 左右。 5.水洗：倾去染液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲洗在涂菌 处，直至载片上流下的水无色为止。 6.干燥：自然干燥，或用电吹风吹干，也可用滤纸吸干，注意不要檫掉菌体。 7.镜检：待标本片完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再 用油镜观察。
免疫组织化学及H E 染色实验步骤
免疫组织化学（ immunohistochemistry） 1组织脱水、包埋及切片 （1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月； （2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇浸泡30min—95%乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—二甲苯 浸泡30min—二甲苯浸泡30min； （3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜； （4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块； （5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5μm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。 2免疫组化染色 （1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯浸泡10min—二甲苯浸泡10min—无水乙醇浸泡5min—无水乙醇浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min； （2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热
细菌的革兰氏染色法及形态观察 一、实验目的 1．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 2．学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。 二、基本原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。革兰氏染色属于最重要的鉴别染色。一般认为革兰氏染色结果的主要原因是由于这两类细菌的细胞壁的结构和化学组成不同。革兰氏阳性菌细胞壁较厚（20-80nm)，主要成分为肽聚糖，网状结构紧密。而革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄（2-3nm)，主要成分是脂蛋白和脂多糖。细菌经过初染和媒染，在细胞内形成深紫色的结晶紫-碘复合物，当用酒精脱色时细胞壁脱水，阳性细菌细胞壁的肽聚糖层网状结构孔径收缩以至关闭，阻止不溶性复合物结晶紫-碘的逸出，这样使菌体呈蓝紫色。阴性菌脂类物质溶解，结晶紫－碘复合物随之被洗脱出，用复染剂复染后菌体呈复染后的红色。 三、实验器材 1．菌种大肠杆菌、藤黄八叠球菌约24小时营养琼脂斜面培养物。 2．仪器普通生物显微镜显微镜 3．材料载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、滤纸、酒精灯、接种环等 4．染料草酸钱结晶紫染色液、路哥氏（Lugol）碘液、95％乙醇、0.5 %番红染色液 四、实验流程 涂片→干燥→固定→初染1min→水洗→媒染1min→水洗→脱色10-30s→水洗→复染1min→水洗→滤纸吸干→镜检。 五、操作步骤 1．涂片 取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴生理盐水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体与水混合。烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径1cm 的均匀薄层，以淡淡的乳白色为宜。制片是染色的关键，载片要洁净，不得玷污油脂，菌体才能徐布均匀。注意初次涂片，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。 2．干燥 涂布后，待其自然干燥或在酒精灯上方稍微加热，切勿靠近火焰。 3．固定 将已干燥好的涂片标本向上，在微火上以钟摆速度通过3-4次进行固定。固定的作用为：a.杀死细菌；b.使菌体蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载片上，染色时不被染液或水冲掉；c.增加菌体对染料的结合力，使涂片易着色。
实验二细菌的简单染色、革兰氏染色 虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。 本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。 一、目的要求 1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。 2．巩固显微镜的使用方法。 二、基本原理 1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。 在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子： 带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。 细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。 2.革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染
微生实验报告 姓名： xx 专业年级：2011级生物技术 学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔
径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种： 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂： 草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚： 乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材： 废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片： 取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干： 让涂片自然晾干。 3．固定：
免疫组化的相关知识！ 一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。 二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 四、免疫组化实验用抗体的选择 1、一抗选择要点 (1)选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。 (2)种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。 (3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书
细菌染色技术 一、细菌的革兰染色法 革兰染色法(Gram stain)是细菌学上最经典的、使用最广泛的一种染色方法。由丹麦细菌学家革兰(Christian Gram)于1883年创立。细菌染色后，不仅可以观察其形态，而且可根据染色结果将细菌分为两大类，即革兰阳性菌(G+菌)和革兰阴性菌(G-菌)。 1、原理： (1)G+菌细胞壁结构致密(肽聚糖层厚)，且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色；G-菌细胞壁结构疏松(肽聚糖层薄)，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。 (2)G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。G-菌菌体内核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。 (3)G+菌等电点比G-菌低，在同一pH条件下阳性菌比阴性菌所带阴电荷要多，故与带正电荷的碱性染料(结晶紫)结合牢固，不易被乙醇脱色。 2、应用 革兰染色法的实际应用意义有三： (1)按照革兰染色法可把细菌分为G+和G-两大类； (2)G+菌和G-菌的致病性不同，所致疾病各异； (3)对G+和G-菌，选择不同抗菌物治疗。 3、材料 (1)葡萄球菌和大肠埃希菌培养18～24h后的混合菌液。 (2)兰染色液：结晶紫染液、碘液、95%酒精、稀释复红或沙黄染液。 (3)载玻片、接种环、酒精灯、吸水纸、显微镜等。 4、方法 标本片制备 (1)载玻片准备：取一张清洁载玻片，用蜡笔在其背面画出二个有一定间隔、直径约1～2cm 的涂抹范围，用数字或符号做好标记。 (2)涂片：将接种环在火焰上烧灼灭菌，冷却后取菌液直接涂布在标记的涂抹范围内。接种环在火焰上烧灼灭菌。
(3)干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于离酒精灯火焰约半尺高处缓慢烘干，切不可放在火焰上烧干。 (4)固定：将干燥后的涂片用片夹夹住，使涂抹面向上缓慢通过火焰3次，然后自然冷却。固定即可杀死细菌，并使细菌固着于玻片上，以免染色时脱落；又可使细菌蛋白凝固，而易着色。 革兰染色法： (1)初染：在固定好并冷却了的涂片上滴加结晶紫染液1～2滴，作用1min后，用细水流从玻片的一端把游离的染液洗去。 (2)媒染：滴加卢戈(Lugol)碘液数滴，作用1min后水洗。碘液是媒染剂，使结晶紫染液与细菌结合更牢固。 (3)脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻晃动玻片，使玻片上流下的酒精液无紫色为止(约需0.5～1min)，流水冲洗。 (4)复染：滴加稀释复红(或沙黄)染液数滴，作用1min后流水冲洗。最后用吸水纸印干标本片或自然干燥后，玻片上滴加香柏油，用油镜观察。 5、结果 G+菌染成紫色；G-菌染成红色。 6、影响因素 ⑴操作因素：涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀，可影响染色结果。固定时避免菌体过份受热。脱色时间要根据涂片厚薄灵活掌握。 ⑵细菌因素：不同时间培养物，革兰染色结果有差异，如葡萄球菌幼龄菌染成紫色。而老龄菌被染成红色。细菌染色时最好用18～24h的细菌培养物。 ⑶染液因素：所有染色液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脱色酒精以95%浓度为宜，若瓶密封不良或涂片上积水过多，可使酒精浓度下降而减弱其脱色能力。 二、细菌荚膜染色法(Hiss法) 1、原理与应用 细菌荚膜是细菌细胞壁外面的一层粘液性物质。其对染料的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染色，即使菌体和背景着色而荚膜不着色。因此在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜含水量在90%以上，染色时一般不用热固定，以防荚膜皱缩变形。荚膜染色法用于有荚膜细菌
免疫荧光组织化学技术 一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述…………………………………………………… 二、免疫荧光组织化学的原理………………………………………………………………… （一）直接方法…………………………………………………………………………… 1．检查抗原方法…………………………………………………………………… 2．检查抗体方法…………………………………………………………………… （二）间接方法…………………………………………………………………………… 1．检查抗体(夹心法)方法…………………………………………………………… 2．检查抗体方法…………………………………………………………………… 3．检查抗原法……………………………………………………………………… （三）补体法……………………………………………………………………………… 1．直接检查组织内免疫复合物方法……………………………………………… 2．间接检查组织内抗原方法……………………………………………………… （四）双重免疫荧光组织化学标记方法………………………………………………… （五）对照试验…………………………………………………………………………… 1．直接方法………………………………………………………………………… 2．间接方法………………………………………………………………………… 3．补体方法………………………………………………………………………… 三、荧光抗体的制备……………………………………………………………………………… （一）荧光素……………………………………………………………………………… 1．异硫氰酸荧光素………………………………………………………………… 2．四甲基异硫氰酸罗达明………………………………………………………… 3．得克萨斯红(Texas red)…………………………………………………………… 4．其它荧光素………………………………………………………………………… （二）荧光素标记抗体的方法…………………………………………………………… 1．FITC标记抗体的方法…………………………………………………………… 2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法…………………………………………… 3．藻红蛋白标记抗体方法…………………………………………………………… 4．蓝色荧光素标记抗体方法………………………………………………………… （三）荧光抗体的质量控制……………………………………………………………… 1．染色特异性和敏感性的测定方法………………………………………………… 2．F/P比值的测定方法……………………………………………………………… 3．荧光抗体的保存…………………………………………………………………… 四、免疫荧光组织化学染色方法………………………………………………………………