细菌染色技术
(2010-11-22 22:29:46)
目的要求
初步掌握细菌涂片制作，单染色法及革兰染色法等染色技术。
实验内容
1．细菌染色一般程序
涂片干燥固定初染(媒染) 脱色复染(1) 涂片临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。
(2)干燥涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。
(3)固定细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3～5次，温度以手能摸时热而不烫为度。目的在于杀死细菌，凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。
(4) 初染不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆盖菌膜为度。
(5) 媒染通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。
(6) 脱色此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。
(7) 复染细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观察。复染液的颜
色与初染液有明显不同。
2．常用染料原液配制
一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量：美兰2g～5g；结晶紫7g～14g；碱性复红3g～7g。
3．常用的染色方法
(1) 单染色法即用一种染料染色的方法。常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。
1) 染液
①吕氏美兰液美兰酒精饱和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成。
②稀释石炭酸复红液碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸馏水作10倍稀释即成。
2) 菌种大肠埃希菌普通斜面培养物。
3) 染色方法于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染色1min，以水冲洗至无颜色流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。
4) 结果以美兰染色者菌体呈现兰色；以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色。
(2)革兰染色法
1) 原理细菌被结晶紫着色后，再经媒染剂处理，染成深紫色或紫黑色。如被酒精脱去颜色，经复红复染成红色，称为革兰阴性菌；如不被酒精脱色，则仍为紫黑色，称为革兰阳性菌。
革兰染色的原理尚未完全明了，主要有三种学说：①等电点学说革兰阳性菌的等电点低(pH2～3)，革兰阴性菌等电点较高(pH4～5)，一般染色液pH值
为7.0左右，故电离后阳性菌所带阴电荷比阴性菌多，因此，摄取带阳电荷的染料（如结晶紫）多且不易脱色。②通透性学说革兰阳性菌细胞壁的通透性比阴性菌小，脱色剂较易通过革兰阴性菌的细胞壁，将染料溶解洗出，故易脱色；阳性菌的细胞壁通透性低，故不易脱色。③化学学说革兰阳性菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它能和染料-媒染剂互相结合，使已着色的细菌不易脱色；革兰阴性菌体含核糖核酸镁盐复合物较少，易被脱色。
2) 染液
①结晶紫染液取结晶紫饱和溶液20ml+1%草酸铵水溶液80ml混合过滤。
②卢戈碘液取碘化钾2ml以10ml蒸馏水充分溶解，然后加碘1g待完全溶解后加蒸馏水至300ml。
③脱色剂95%乙醇。
④稀释石炭酸复红同单染色法。
3) 菌种大肠埃希菌和葡萄球菌混合菌液。
4) 方法
①初染将结晶紫染液2～3滴加于制好的涂片上，染色1min，水洗；
②媒染加卢氏碘液2～3滴染色1min，水洗；
③脱色95%乙醇脱色0.5min(无紫色脱落为止)，水洗；
④复染加稀释石炭酸复红数滴，染色1min，水洗干后镜检。
5) 结果革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌染成红色。
6) 注意事项①涂片不宜过厚，否则脱色受影响，使革兰阴性菌染成革兰阳性菌，造成错误鉴定。②为防止染液蒸发而改变浓度，碘液的颜色变淡应弃去。
③涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果，故每次水洗后应将玻片甩干。
④注意细菌的菌龄，一般以18h～24h左右培养物效果最好，菌龄过长影响细菌染色性。
(3) 萋-纳抗酸染色法(ziehl—neelsen)：主要用于结核杆菌和麻风杆菌检查。
1) 染液
①石炭酸复红染液取碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸水溶液90ml混合。
②脱色剂3%盐酸酒精。
③复染剂吕氏美兰染液，同单染色法。
2) 菌种卡介苗和表皮葡萄球菌混合液。
3) 方法
①初染在已固定的涂片上滴加石炭酸复红染液，远火徐徐加热至有蒸汽冒出，但切不可沸腾，并随时添加染色液，染色3 min～5min，冷却后水洗。
②脱色滴加3%盐酸酒精脱色至无红色流下为止，一般为2min。
③复染水洗后用吕氏美兰复染0.5 min～1min，水洗干后镜检。
4) 结果抗酸菌染成红色，非抗酸菌染成蓝色。
5) 注意事项①加热时火切勿过大，防止染液沸腾。②每张玻片只允许放一份标本，以免阴阳结果混淆。③用过的玻片要彻底洗干净，防止抗酸菌留在玻片上。④切勿使用染色缸，印干的滤纸只能一片一张，不得重复使用。⑤脱色时间宁长勿短，以免误诊。⑥为防止实验室感染，标本要高压灭菌后再制片。
(4) 潘本汉抗酸染色法(panpenhein) 主要用于尿及粪便中抗酸菌检查。当用萋-纳抗酸染色检出抗酸菌后，用该方法染色，结核分枝杆菌染成红色，耻垢分枝杆菌染成蓝色。
1) 染液
①石炭酸复红染液见萋-纳抗酸染色法。
②复染液取蔷薇色酸1g先溶于100ml无水乙醇中，然后加美兰2g(至饱和)，置室温中4天，使其充分溶解，过滤后加甘油20ml混匀备用。
2) 标本怀疑肾结核患者的尿液。
3) 方法
①初染于制好的涂片上滴加石炭酸复红染液数滴加温染色2min。
②复染倾去染液勿水洗，滴加复染液，边滴边倾去，重复4～5次后，水洗、待干、镜检。
3) 结果结核分枝杆菌染成红色，耻垢分枝杆菌及其他细菌染成蓝色。
(5) 鞭毛镀银染色法
1) 染液
①甲液鞭酸5g，三氯化铁5g，36%甲醛1ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100ml。
②乙液取AgNO3 2g溶于100ml蒸馏水中，临用前用15%氨水滴定，出现棕色沉淀后继续滴加氨水直至呈现乳白色薄雾状为止。
2) 方法
①将奇异变形杆菌在1.4%的软琼脂上传两代，形成迁徙生长现象。取洁净玻片一张，于玻片上滴加蒸馏水一滴，然后取上述迁徙生长边缘的细菌少许，轻轻点于蒸馏水中，使其自然扩散、干燥，切勿火焰固定。
②在制好的涂片上滴加甲液染3 min～5min，用蒸馏水冲洗。
③用乙液冲去残水后，加乙液0.5 min～1min，并在火焰上方稍加热，用蒸馏水冲洗，干后镜检。
