第十二章 印迹杂交技术

二、RNA印迹法（Northern blot）
操作：与Southern印迹极为相似，但不需要酶切可直 接变性转移； RNA经变性后再电泳（可用甲酰胺、甲醛等 使RNA变性，不能用碱，易使RNA降解）； 电泳时不能加EB，影响RNA与膜结合； 严防RNase污染。 用途：检测RNA（定性或定量分析细胞内总RNA或 某一特定RNA，特别是分析mRNA的大小和含 量）——研究基因插入缺失等突变、基因表达（金 标准）。
一、核酸探针
——带有标记物且序列已知的核酸片段， 能与待测核酸中的特定序列特异杂交。
• 核酸探针是否合适是决定核酸杂交分析 能否成功的关键。
核酸杂交与分子探针
核酸探针应具有的条件
① 特异性高：只与待测核酸样品中的 互补序列杂交。 ② 带有标记物：标记物灵敏度高而稳 定，检测方便。
核酸探针的种类
常用核酸杂交分类
杂交方法
Southern印迹 Northern印迹 斑点杂交 菌落杂交和噬斑杂交
适用范围
检测经凝胶电泳分开的DNA 分子,需转印到膜上 检测经凝胶电泳分开的RNA 分子,需转移到膜上 检测未经分离的,固定在膜上的 DNA或RNA分子 检测固定在膜上的,经裂解后从 细菌和噬菌体中释放的 DNA分子 检测细胞或组织中的DNA或 RNA分子
2.非放射性标记物
优点：无环境污染，可长时间贮存。 • 生物素：
一种小分子水溶性维生素，连接在碱基上 和抗生物素蛋白（avidin）特异结合 抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等) 。 • 酶促显色：
碱性磷酸酶（ALP或AKP）：催化底物（5-溴-4-氯-4吲哚 磷酸，BCIP）和硝基蓝四氮唑（NBT），生成不溶性紫色 化合物二甲臜； 辣根过氧化物酶（HRP）：催化底物二氨基联苯胺（DAB） 生成红棕色沉淀物；或催化底物四氨基联苯胺（TMB）生 成蓝色沉淀物。
第一节 核酸杂交的 基本概念
温度、酸碱、有 机溶剂、尿素等
核酸变性：在某些理化因素作用下，核 酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺 旋结构松散变成单链的过程。
DNA变性：在变性因素作用下，DNA分 子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结 构解开成两条单链的过程。
DNA复性（renaturation）：在适当条 件下，变性DNA的两条互补链可恢复天 然的双螺旋构象。
cDNA探针
优点： mRNA逆转录而来，不含内含子等 非编码区，特异性高；适用于研究基因表达。 缺点：获取过程复杂，不易制备
RNA探针
① 是单链探针，所以不会自身退火，与待测 核酸的杂交效率较高，杂交体稳定性更好 ② 不含高度重复序列，非特异性杂交也较少 ③ 杂交之后可以用Rnase将未杂交的游离RNA 探针降解，从而降低本底干扰 ④ 缺点：容易降解
• DNA末端标记法只是将DNA片段的一端（5’ 端或3’端）进行部分标记。 • 缺点：标记活性不高，标记物掺入率低， 一般极少用做核酸分子杂交探针标记。
第三节 固相支持物与印迹
DNA印迹杂交的主要步骤
• • • • 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 印迹（转膜）： – 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 – 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 预杂交（封闭） 探针的制备 固相膜上杂交（控制温度） 洗膜：除去游离的探针 杂交信号的检测
－－杂交本底较高；不能用于蛋白质印迹。
3）聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride， PVDF膜）
• 常用于蛋白质印迹 • 膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低
分子量的蛋白结合就越牢固。
• 具有较高的机械强度，可进行多轮杂交。
• 缺点：本底较高、不能用于荧光分析；使用时需要
定于固相支持物，然后与溶液中的游离探针（或 待测核酸）进行杂交，形成的杂交体结合于固相 支持物上。
第二节 核酸探针与 标记
探针(probe)
——能与待测的分子发生特异性相互作用， 并可被特殊的方法探知的分子（带有标记 物）。
• 探针的检测对象：核酸、蛋白质、细胞结构等。 • 除核酸探针外，探针利用抗体-抗原、配体-受 体等相互作用的原理与靶分子结合。
2）尼龙膜（nylon membrane）
• 结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达
350µg/cm2 ～ 500µ g/ cm2 ）。
•真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射
后, 部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。 DNA变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。
•微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、 • 韧性较强，操作方便。 • 能结合小分子核酸。 • 低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。 • 可反复杂交和洗膜。
核酸探针的选择
① 多数情况（DNA探针） ② 靶序列单个碱基改变，如SNP分析（寡 核苷酸探针） ③ 复杂的靶核苷酸序列和病原体（特异性 较强的长的双链DNA探针） ④ 组织原位杂交（寡核苷酸探针、短的 PCR标记探针（80~150nt）——易透过细 胞膜） ⑤ 基因表达水平（长的核酸探针，可达 300nt）
寡核苷酸探针
① 根据已知核酸序列人工合成的DNA探针； 或根据基因产物氨基酸序列推导合成。 ② 复杂程度低，故杂交所需时间短； ③ 是单链DNA探针，不会自身退火； ④ 长度一般为17～50 nt，只要其中有一 个碱基不配对就会影响杂交，可用于分 析点突变。 ⑤ 缺点：不如长的杂交核酸分子稳定。所 带标记物较少，特别是非放射性标记时， 灵敏度较低。因此当用于单拷贝基因的 Southern印迹杂交时，以采用较长的探 针为好。
二、核酸探针标记物
分类：放射性标记探针
非放射性标记探针
1.放射性同位素
——应用广泛，以32P应用最普遍，放射 自显影；此外，还有3H、35S。 优点：灵敏度高； 缺点：放射性污染，半衰期短、不稳定等。
32P：产生β射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记物， 但半衰期短（14.3天）：α位和γ位标记。 35S：分辨率高、半衰期长（87.1天）敏感度低
常用固相支持物
1）硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane） 缺点：
① 不易洗膜：真空烘干后，依靠疏水性相互作 用，因此亲和力低，杂交后漂洗时易被洗掉 （特别<200nt的DNA片段、蛋白质印迹时）； ② 与核酸结合依赖高盐：低盐结合不佳，不易 核酸电转； ③ 碱性条件不能结合核酸； ④ 不易反复杂交：质地较脆，烘烤后更甚
三、核酸探针的制备
• 常将标记物连接到某种脱氧核糖核苷三磷 酸(dNTP)上，然后可通过切口平移法、随 机引物法、PCR标记法、末端标记法等标 记探针。
切口平移法
反应成分： Dnase I、E coli DNApol I， dATP、dGTP、dTTP、32P-dCTP， 待标记的DNA片段 标记结果： 两条链都均匀标记。
退火（annealing）：热变性的DNA经缓 慢冷却后即可复性。
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
• 增色效应：核酸在变性过程中260nm 波长吸收值（ A260 ）增加
• 减色效应：核酸在复性过程中260nm 波长吸收值（ A260 ）减小
DNA加热 50%DNA 发生变性 此时的温度——解链温度 （melting temperature, Tm）
随机引物法（random
priming )
反应成分：随机聚核苷酸引物，待标记DNA模板，Klenow 片段，dNTP中一种带放射性标记。
PCR标记法
• 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标 记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就 可在PCR反应的同时掺入到新合成的 DNA链上。
末端标记法
地高辛：
一种类固醇半抗原分子 可利用其抗体进行免疫检测 原理类似于生物素的检测。
核酸探针标记的选择
① 灵敏度高（放射性探针） ② 灵敏度要求不高（非放射性探针，如保 存时间长的生物素探针和比较稳定的碱 性磷酸酶显示系统） ③ 常用的放射性同位素：3H标记探针半衰 期长、成像分辨率高、便于定位，但能 量低；35S标记探针活性高、成像分辨率 也好；32P能量过高，易使影像模糊，不 利于确定杂交位点。 ④ 浓度：过度会产生较高本底，一般不超 过100ng/ml。
G—C百分含量与Tm的关系
核酸分子杂交
单链的核酸分子在合适条件下，与具有碱 基互补序列的异源核酸形成杂化双链的过 程。
• 核酸分子杂交可在DNA与DNA、DNA与RNA、RNA 与RNA的两条单链间进行。
核酸分子杂交的体系
液相杂交：待测核酸和探针均游离于溶液。 固相杂交（常用）：将待测核酸（或探针）固
切口平移法
• 限量DNase I在待标记的双连DNA的每一条连上产生若干个单连 缺口； • 利用E.coli DNA DNApol I 的5’-3’外切酶活性和5’-3’聚合酶活性， 在缺口处5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸， 以修补缺口。 • 随着缺口在5’末端的移动修饰的核苷酸就掺入到新合成的DNA连 中。
第十二章 印迹杂交技术
Molecular hybridization
印迹技术(blot)
——指将电泳分离的样品（核酸或蛋 白质）从凝胶转移到印迹膜上，然后 与标记探针进行杂交来检测样品的方 法。lot Northern Blot Western Blot Eastern Blot DNA印迹 RNA印迹 蛋白质印迹（免疫印迹） Western Blot的一种变形
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固相支持物与有效的印迹方法是印 迹技术成败的关键。
常用固相支持物
1）硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane） 优点：