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医学分子生物学第九章印迹杂交技术

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Northern印迹杂交技术

Northern印迹杂交技术

5.酶联免疫染色 5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 室温，用缓冲液Ⅰ min， min，再用缓冲液Ⅰ Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。 min。 • 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（ 2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。 4℃只能稳定 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 • 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去未 缓冲液Ⅱ洗膜2 每次15 min， 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液 缓冲液Ⅲ 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液Ⅲ平 衡膜2 min。 衡膜2-5 min。
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常用 杂交是用于RNA RNA定量和定性分析的常用 技术，它是将RNA RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上， 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核 酸分子杂交的一种实验方法。 酸分子杂交的一种实验方法。 • 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源RNA的存 可以鉴定总RNA RNA或 RNA样品中同源RNA的存 样品中同源RNA 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， mRNA分子的大小和丰度 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， 是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调 节以及cDNA合成的重要手段。 节以及cDNA合成的重要手段。 cDNA合成的重要手段
浸泡在 250 ml tris*NaCI 室温、 室温、30r/min 30min。 。

southern印迹杂交名词解释

southern印迹杂交名词解释

southern印迹杂交名词解释Southern印迹杂交是生物学中一个重要的术语，它来源于美国生物学家Edwin Southern所发明的南方杂交技术。

这种技术通常用于DNA分子的检测与分析，在生命科学研究领域具有重要的应用价值。

1.什么是Southern印迹？Southern印迹，又称Southern blot，是一种通过琼脂糖凝胶电泳和酶解技术，将筛选出的DNA样本在膜上进行定向转移，并与特定探针杂交的技术，可以用于检测和分析目标DNA序列。

2.什么是杂交？杂交是指在DNA的两条链之间发生的配对作用。

它是生物学中基本的遗传现象，决定了每个个体的基因型和表型。

3.什么是南方杂交技术？南方杂交技术是一种高效的分子生物学技术，广泛用于分析DNA序列、检测特定基因等方面。

它利用核酸探针与目标DNA的互补配对关系，识别目标DNA序列。

在使用Southern blot技术时，DNA样品首先通过电泳将不同长度的DNA分离出来，然后将其转移到琼脂膜上。

接着，利用探针特异性杂交，标记目标DNA的特定区段。

最后，利用探针上的标记（如酶或荧光）将目标DNA区段从杂交物质中分离出来并检测，以获取样品的DNA序列和长度信息。

4. Southern印迹与Northern印迹、Western印迹有什么不同？Southern印迹用于检测已知DNA序列，与之对应的Northern印迹用于检测RNA序列，而Western印迹则是用来检测蛋白质。

三种印迹技术都是利用探针与目标分子的互补配对关系，识别目标分子，并将其从杂交物质中分离出来以便检测。

5. Southern印迹技术的应用Southern印迹技术具有广泛的应用价值。

它可以用于检测和鉴定病菌、遗传疾病、肿瘤等疾病相关基因，进行生物工程和基因工程的基因克隆和筛选，进行DNA序列测定和鉴定等。

不仅如此，该技术也可以应用于无机化学、有机化学、分析化学等领域。

总之，Southern印迹技术的出现和发展，促进了生命科学、医学和生物工程等领域的发展，也推动了DNA以及其他分子的检测和分析研究。

分子印迹(渍)与分子杂交技术

分子印迹(渍)与分子杂交技术

• DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。 •对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、
NL不具备) －－结合能力较NC膜低 －－活化过程较复杂是指将核酸,蛋白质等生物大分 子固定在纤维膜上的过程。将核酸或 蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上 或直接将核酸点到膜上。 （1）物理吸印方法
原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要 因素，标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重 要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl处理载玻片，用蛋 白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水，原位杂交还是一 种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需 要进一步完善和提高 用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以 是RNA探针。通常探针的长度以100～400nt为宜，过长则 杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16～ 30nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于 长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA 探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探 针。
⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min。SSPE 配成20×贮备液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。
⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。
固相核酸分子杂交类型



Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置

医学分子生物学第九章印迹杂交技术

医学分子生物学第九章印迹杂交技术
cDNA； 分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两种
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
辣根过氧化物酶源自底物产物， 并发出光辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA

Northern-Blot印迹杂交

Northern-Blot印迹杂交
在提取RNA时，应确保样品新鲜并立 即进行实验，避免长时间暴露于环境 中导致RNA降解。
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
• 转录水平低：考虑使用其他组织 或细胞类型进行实验，以确定目 标基因是否在所选样本中表达。
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
解决方案
2. 使用更高效的RNA提取方 法，确保获得高质量的RNA 样品。
样本电泳
01
02
03
选择合适的胶浓度
根据RNA的大小选择适合 的琼脂糖凝胶浓度，确保 RNA片段能够充分分离。
点样与电泳
将处理好的RNA样品点在 凝胶上，并进行电泳分离。
检测RNA条带
通过染色或放射自显影等 技术观察电泳结果，确保 RNA片段已成功分离。
样本转移
制备滤纸
选择适合的硝酸纤维素膜 或印迹膜，并将其固定在 滤纸上。
northern-blot印迹杂交
contents
目录
• northern-blot技术概述 • northern-blot实验原理 • northern-blot实验材料与设备 • northern-blot实验步骤 • northern-blot实验结果分析 • northern-blot实验问题与解决方案
01 northern-blot技术概述
定义与特点
定义
Northern-blot印迹杂交是一种用于 检测RNA在样本中的表达水平的分 子生物学技术。
特点
具有高灵敏度、高特异性和高分辨率 ，能够检测出微量的RNA分子，并可 对RNA分子进行定性、定量和定位分 析。
northern-blot技术的应用范围
1. 重新设计探针并进行验证， 确保与目标基因完全匹配。
3. 优化实验条件，如延长杂 交时间和提高探针浓度。

分子杂交和印迹技术-文档资料

分子杂交和印迹技术-文档资料

（三）蛋白质印渍技术 Western blotting
• 又称为Western杂交，或免疫印渍技 术，即利用抗原-抗体反应，检测转移 到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 • 应用：用于检测样品中特异性蛋白质 的存在、细胞中特异蛋白质的半定量 分析以及蛋白质分子的相互作用研究 等。
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
– 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质
• 探针的选择和标记 • 杂交 • 杂交结果检测
FISH（fluorescence in situ hybridization）技 术是一种重要的非放射性原位杂交技术。 它的基本原理是:如果被检测的染色体或靶 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二 者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核 酸探针的杂交体。 将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子 如生物素、地高辛，可利用该报告分子与 荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学 反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA 进行定性、定量或相对定位分析。
原位杂交 in situ hybridization
• 即组织原位杂交，指组织切片或细胞 涂片直接用于杂交分析。先经适当处 理，使细胞通透性增加，让探针进入 细胞内与DNA或RNA杂交。 • 因此原位杂交可以确定探针的互补序 列在胞内的空间位置，这一点具有重 要生物学和病理学意义。
原位杂交(in situ hybridization)
（一）DNA印迹技术 Southern blotting
• 又 称 为 Southern 杂 交 ， 即 DNA-DNA 杂交分析，是研究 DNA 图谱的基本技 术，主要用于基因组 DNA 的分析，如 在基因组中特异基因的定位及检测等， 在遗传诊断 DNA 图谱分析及 PCR 产物 分析等方面有重要价值。

southern印记杂交


实验步骤
基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III） 电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链） 转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上， 紫外交联固定） 预杂交（减少标记探针的非特异性结合， 小分子鲑精DNA为竞争性封闭剂） 杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以 碱基互补的原则进行杂交） 洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针） 检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
体积越小,杂交动力学越高;
DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃;
温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用) 高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
Southern杂交技术原理
Southern杂交技术是由Edward M. Southern在 1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交 技术，并因此而得名 根据毛细管作用的原理，将在电泳凝胶中分离的 DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过 与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测 这些被转移的DNA片段。
1d
1d 1d
实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样 1.基因组DNA10 mg 2.酶切样品（1） 3.酶切样品（2） 4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml) 5.酶切样品（1） 6.酶切样品（2） 7.基因组DNA10 mg

医学分子生物学原理-分子杂交和印迹技术

最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。
2020年3月4日1时8分
15
DNA切口平移标记法示意图
DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链DNA上随机打开 若干个单链缺口， 产生3’-OH端。
大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 Ⅰ ： 5’→3’ DNA聚合酶活性； 5’→3’ 外 切 核 酸 酶活性。
➢ 将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼 脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一 段时间后，对菌落进行原位裂解。
2020年3月4日1时8分
6
核酸分子杂交应用
（1）特定基因序列的定性和定量分析 （2）基因克隆的筛选 （3）酶切图谱的制作 （4）基因突变分析 （5）疾病的诊断
2020年3月4日1时8分
7
二、探针的种类和制备
探针(probe)的概念： 用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列
的DNA或RNA的互补标记片段：
5′ 3′ 5′
3′
53′′ 5′
3′
2020年3月4日1时8分
3′ 5′ 限制性内切酶
3′ 5′
Klenow DNA聚合酶
完整双链DNA
5 ′末端突出 的DNA
[α-32P]-dNTP 其他3 种dNTP
变性
35 ′′
3 ′末端标记的 DNA
3 ′ 32P-末端标记的
5′
单链DNA探针
21
标记探针的纯化
Luminol化学发光原理
1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟；
2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。
思考题：
2020年3月4日1时8分
29

分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术 ppt

分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术摘要：上世纪70年代美籍华裔科学家简悦威采用Southern印迹杂交技术成功诊断了α地中海贫血症和镰状细胞贫血症，开创了临床分子生物学检验的先河，他是怎样做到的呢？知识点：分子杂交、核酸分子杂交、探针Southern印迹杂交、琼脂糖凝胶电泳技术、印迹技术临床分子生物学检验技术的发展第一阶段：分子杂交第二阶段：PCR第三阶段：生物芯片第四阶段：DNA测序美籍华裔科学家简悦威应用DNA分子杂交技术诊断α地中海贫血(1976)、镰状细胞贫血(1978)分子杂交(molecular hybridization) 两条单链核酸、抗原与抗体、受体与配体等经相互作用重新组成新的杂交分子图片源于网络非原创核酸分子杂交两条序列互补的单链核酸之间(DNA 与DNA ，DNA与RNA或RNA与RNA)借助氢键相连形成杂合双链碱基互补配对A=T,A=U,C≡G杂合双链图片源于网络非原创核酸分子杂交：待测核酸与探针图片源于网络非原创核酸探针 (nucleic acid probe)能与待测靶核酸特异互补杂交的已知被标记的核酸分子核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P、3H、35S等2.非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素等分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交Southern印迹杂交(E.M.Southern,1975) ——镰状细胞贫血症的分子诊断(1978)琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创琼脂糖凝胶电泳技术——分离、纯化、鉴定核酸 碱性缓冲液 琼脂糖凝胶 负极 正极核酸加样孔 电极琼脂糖凝胶电泳技术可将分子量和构象不同的核酸分子进行分离小分子量核酸电泳结束后不同分子量的核酸的迁移位置琼脂糖凝胶电泳技术图谱DNA Marker 核酸样品琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术印迹技术 (Blotting）将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上印迹技术膜核酸凝胶琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创应用Southern印迹检测红色特异DNA片段1. 从样品中提取DNA并通过限制性核酸内切酶消化样品DNA2.消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离3. 凝胶中DNA经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交6. 通过洗涤除去未杂交的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段Southern 印迹技术1. 通过限制性核酸内切酶消化样品DNA，2. 消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离，3. 凝胶上被分离好的DNA片段经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定，5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交，6. 杂交后洗脱未特异结合的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA 片段杂交检测杂交信号预杂交制备携带标记的核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针图片源于网络非原创应用Southern印迹杂交技术诊断镰状细胞贫血？分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术。

核酸印迹与分子杂交


5'
下游 3' 引物
5'
R
3' 5'
Q
5'
21
3'
DNA序列测定
DNA Sequencing
DNA序列分析方法
• 双脱氧链终止法 利用2′，3 ′-双脱氧核苷酸掺入中， 终止化学反应
• 化学裂解法 利用化学试剂裂解修饰碱基终止聚合反应
戊 糖
HO CH2 5´ O OH HO CH2 O OH
4´ 3´
westernblot蛋白免疫印迹技术是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中转印到化学合成膜的支撑物上利用特异性抗体进行反应定性分析蛋白质
分子生物学技术
高 颖
gaoying822@
核酸印迹技术与分子杂交
Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization
原位分子杂交技术
利用分子杂交技术来进行基因及其表达 产物定位分析的一种技术。 组织、细胞或染色体的固定；
探针；
与探针结合的标记物； 可用于基因及其表达产物的定位分析。
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction
聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR）
基本操作过程
–待测DNA样品制备、基因探针标记；
–待测DNA样品的电泳分离； –电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的 固相支持物； –特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自 显影或显色检测目的DNA的存在。
Southern blot基本流程
酶切DNA样品上样
重物
DNA印迹
电泳
转移
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数据分析
二、蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein chip) 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点
阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反 应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统 对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
蛋白质芯片作用原理 蛋白质分子间的亲和反应
干姜附子肉桂造模的血清细胞因子芯片检测（L Series 90: RayBio® Labelbased Rat Antibody Array ，货号：AAR-BLM-1-2 ） Normal
（2）Western blotting
① Western（转膜）
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼 龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场
的作用下横向转移到正
胶
膜
极一侧的膜上。
蛋白
Western装置
② Blotting
PAGE胶 待测蛋白
硝酸纤 维素膜
待测蛋白 一抗 二抗
多克隆抗体 Blotting的结果
基因芯片及数据分析
一、基因芯片的技术原理 二、基因芯片的点制过程 三、基因芯片的数据分析
基因芯片
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
基因芯片
芯片杂交操作流程：
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段； 用机悈手将PCR产物点在玻璃板上，变性、固定。 分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成
基本程序（1）细胞或组织固定及切片 （2） 预杂交及杂交（3）冲洗 （4）放射自显影或 标记酶显色
原位杂交的原理
原位杂交的原理
肌肉 组织 块
石蜡切片机
切片
显色
/u62/v_NDA2NDUxMzk. html
杂交
蛋白印迹法
（四）免疫印迹（western blotting）法
Model
造模后，基因上调3倍的细胞因子
Colum n
Name
8 Activin A (激活素A)
15 beta-Catenin（连环蛋白）
16 basic-FGF（成纤维生长因子）
17 beta-NGF（神经生长因子）
23 CNTF R alpha（睫状神经营养因子）
26 EGFR
22 ICAM-1/CD54（细胞间黏附分子）
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
电泳buffer 在电场的作用下线性蛋白 质链在聚丙烯酰胺凝胶介 质中向正极移动，移动的 速率主要取决于其分子量 大小（链的长短），从而 把不同分子量的肽链分开。
电泳buffer
点样
电泳方向
③蛋白质电泳的
Da
分子量标准
已知分子量的蛋白质混合 液，与待测样品一起电泳， 为样品蛋白质提供分子量 估计。
6744 8989.5
9067 8188.5 11189.5 11970.5
标准值
model
0.5266084
0.1231144 0.1709812 0.1681187 0.0986358 0.0467252
0.304313 0.2205064 0.2132026 0.3539745 0.4776853
基因表达谱芯片
分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录 生成cDNA
基因表达谱芯片
将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。
Tumor Sample
Normal Sample
基因表达谱芯片
激光扫描芯片杂交结果，计算机处理
杂交需要进行重 复性实验，主要的 方法是两次平行杂 交反应，将每个基 因在两个反应中的 表达水平做成对应 散点图，只要绝大 多数基因杂交结果 都在45度斜线附近， 就说明实验结果是 可靠的。
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
3.139409 7.4948105 3.5414525 4.8324688 3.4086302 4.7152206 3.1677641
3.701377
组织芯片（tissue microarry）
是近年发展起来的以形态学为基础的分子生 物学新技术。它是将数十倒上千种微小组织切片 整齐排列在一张基片上制成的高通量微阵列，可 以进行荧光原位杂交（FISH）或者免疫组化 （immunohistochemistry）分析。因此组织芯片 是传统的核酸原位杂交或免疫组化分析的集成。
第八章 印迹杂交技术
分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique
Hale Waihona Puke 一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂化双链(heteroduplex) 。
cDNA； 分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两种
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
菌落杂交
滤膜
将滤膜与标记探针杂 交
挑选相应的菌落 进行培养
细菌平 板
原位杂交的原理
原位杂交由Gall，Pardue和Buongiorno于 1969年首次报道，是用标记好的核酸做探针， 在原位检测细胞或组织切片内特定核酸序列的 方法。原位杂交根据检测物的不同可分为细胞 内原位杂交和组织切片原位杂交。
辣根过氧
化物酶
底物
产物， 并发出光
辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
normal
0.1404062
0.0374126 0.0423561 0.0535511 0.0131605 0.0131938 0.0629726 0.0646906 0.0452158 0.1117427 0.1290561
比值
model vs normal 3.7506058
3.2907207 4.0367534
组织蛋白芯片
组织芯片
四、显影检测
二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为6×1023道尔顿
Dalton SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色：
1）直接染色
考马斯亮蓝： 灵敏度低、只能检出>0.3-1μg/带，但可 褪色回收。
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
2）转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
其他： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) 菌落杂交（colony hybridization ）
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
Sourthern杂交步骤
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
（二）探针标记
用放射性核素、生物素或荧光染料标记其 末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为 “探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷 酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。
放射性标记
P32
非放射性标记
（三）印迹技术
利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子 转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因 此称之为“blotting”，译为印迹技术。
1、提取基因组DNA
2、用限制性内切酶消化DNA， 使其变成DNA片段
3、将消化过的DNA片段跑琼 脂糖凝胶电泳
4、将核酸样品转移到固体支 持的滤膜上
5、将具有核酸印迹的滤膜与 带有放射性标记或其它标记的 DNA或RNA探针进行杂交。
6、进行显影（进行曝光或者 是染色显影）
②
③ ①
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