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免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化的完整步骤及各步原理大家好，今天咱们聊聊免疫组化这门技术。
它可是生物医学研究中的一把好手，能让细胞和组织的秘密无所遁形。
咱们先从免疫组化是什么说起。
首先得明白，免疫组化是一种研究方法，它通过给样品加上抗体，让它们跟细胞里的蛋白质或分子“亲密接触”，然后通过染色来观察这些蛋白质或分子的位置和分布。
听起来是不是挺高大上的？不过别急，咱们慢慢来，一步步揭开它的神秘面纱。
1.1 准备工作开始之前，你得确保所有材料都是新鲜的、高质量的，还有那试剂啊，得是实验室里常用的那种。
别忘了准备一个显微镜，这可是观察的关键哦！1.2 固定和包埋接下来就是让细胞和组织固定在一块，这个步骤叫做固定。
把样本放到甲醛溶液或者丙酮里面一泡，就能把它们牢牢地锁住，防止它们移动。
之后呢，把固定好的样本放进树脂里，这样它们就能稳稳当当的了。
这一步是为了保护细胞和组织的结构不被破坏，方便后续的切片和染色工作。
1.3 切片把处理好的样本切成薄片，这就是切片。
切片的时候得小心，别让样本碎掉或者变形。
切片后，还得把那些乱七八糟的东西去掉，比如蜡质啊、气泡啊，这样才能让下面的染色工作顺利进行。
1.4 染色染色可是个技术活。
你得选对染料，颜色要鲜艳，还要能穿透细胞膜，把里面的物质找出来。
染色的方法有很多种，比如直接法、间接法和免疫荧光法等等。
每种方法都有它的特点，就像不同的人有不同的爱好一样。
1.5 观察染色完成后，就可以用显微镜来观察啦！看看细胞和组织里的蛋白质、分子是怎么分布的。
有时候，你还能发现一些有趣的现象，比如某些细胞里藏着很多糖，还有些地方有抗体的“家”。
这些观察结果可是非常宝贵的，能帮助我们更好地理解生物体内的奥秘。
2.1 注意事项做免疫组化实验的时候，可不能马虎哦。
记得要戴好防护眼镜和手套，避免接触到有毒有害物质。
操作时要轻柔，不要破坏样本的结构。
还有啊，处理完样本后得洗手，保持实验室的清洁和卫生。
2.2 常见问题及解决方案有时候会遇到一些问题，比如样本太干或者太湿，这时候可以试试加一点水或者甘油来调整。
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种非常神奇的实验技术，它可以让科学家们观察到细胞内部的微小世界。
那么，这个神奇的过程到底是怎么进行的呢？下面就让我们一起来揭开免疫组化的神秘面纱吧！我们要了解一下什么是免疫组化。
简单来说，免疫组化就是利用特定的抗体去识别和标记细胞表面或者细胞内部的一些蛋白质分子。
这些抗体可以是医生们自己设计的，也可以是从动物或者植物中提取出来的天然抗体。
当这些抗体与目标蛋白结合时，就会发生一些特殊的反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
通过观察这些反应，科学家们就可以了解到细胞内部的结构和功能特点。
接下来，我们来看一下免疫组化的完整步骤及各步原理。
首先是样品制备，也就是把待测的细胞样本取出来进行处理。
这个过程非常重要，因为只有处理好的样品才能够被抗体识别和标记。
接着就是抗体制备，也就是把医生们设计好的抗体合成出来。
这个过程需要一定的技术和经验，因为不同的抗体可能适用于不同的细胞类型和目标蛋白。
然后就是抗原检测，也就是把制备好的抗体加入到样品中，看看它们是否能够与目标蛋白结合。
如果结合了，就会发生一些特殊反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
最后就是结果分析，也就是根据观察到的反应来推断出细胞内部的结构和功能特点。
虽然免疫组化看起来很复杂，但是只要掌握了其中的原理和技巧，就可以轻松地完成实验了。
当然啦，在实际操作过程中也会遇到各种各样的问题和挑战，比如说抗体的选择、样品的质量等等。
但是只要我们保持耐心和信心，相信总会找到解决问题的方法的。
免疫组化是一项非常重要的技术，它可以帮助我们更好地了解细胞内部的结构和功能特点。
虽然它看起来有些复杂难懂，但是只要我们认真学习和实践，相信一定可以掌握其中的精髓并取得优异的成绩！。
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化方法
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测组织或细胞中特定蛋白质
的表达和定位。
其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，再通过
染色或荧光标记等方法来检测抗体与蛋白质的结合情况。
免疫组化方法主
要包括以下几个步骤：1.样品制备：将组织或细胞样品固定、切片或涂片
等处理，以便于后续的抗体结合和检测。
2.抗原修复：对于某些抗原易于
失活或难以检测的样品，需要进行抗原修复处理，如加热、酶解等，以恢
复抗原的结构和活性。
3.抗体结合：将特异性抗体加入样品中，与目标蛋
白质结合形成免疫复合物。
抗体可以是单克隆或多克隆，也可以是直接标
记或间接标记的。
4.洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体和杂质，以减少假阳性的干扰。
5.检测标记：将荧光标记、酶标记或金标记等标记
物加入样品中，与免疫复合物结合，以便于检测和定位。
6.显色或荧光：
通过染色或荧光显微镜等设备，观察样品中的免疫复合物的分布和定位，
以确定目标蛋白质的表达和定位情况。
总之，免疫组化方法是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开
发等领域。
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
细胞免疫组化实验步骤细胞免疫组化实验步骤：1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。
而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。
PBS洗3次，3 min/次。
2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3次，3 min/次。
3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。
这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。
（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。
PBS洗3次，3 min/次。
4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。
此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。
5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃1-2h。
PBS洗3次，3 min/次。
（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）6）孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃1-2h，PBS洗3次，3 min/次。
7）切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。
8）复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化的完整步骤及各步原理1. 引言免疫组化，听起来就像科学家们的秘密武器，其实它在病理学和生物医学中扮演着不可或缺的角色。
简单来说，这个方法能帮助我们在组织切片中找出特定的蛋白质，就像在侦探故事中找线索一样。
你可能会想：“这玩意儿到底是怎么回事？”别急，今天就带你深入了解免疫组化的每一步，绝对让你大开眼界。
2. 准备工作2.1 组织样本的获取首先，我们得有个“样本”。
这就像做菜，得有食材。
我们通常会从病人那儿获取组织切片，可能是肿瘤、炎症等地方。
切片越薄，越能让我们看的清楚，像是把面包切得薄薄的，涂上黄油才好吃。
2.2 切片处理接下来，把这些切片用固定剂处理，最常用的是福尔马林。
这个步骤就像给切片穿上“保护衣”，确保里面的蛋白质不会在过程中跑掉。
然后，我们还得用乙醇脱水，把水分抽走，这样才不会稀释我们要找的“宝贝”。
最后，用二甲苯清洗，让切片变得干净透亮，准备好迎接接下来的挑战。
3. 免疫反应3.1 抗体的选择免疫组化的核心就是抗体。
选择抗体就像选队友，得找对的！我们得确保这个抗体是专门针对我们想要检测的那个蛋白质的。
想象一下，你在寻找某个特定的明星，当然得找那个最熟悉的粉丝来帮忙。
3.2 抗体结合一旦选择好抗体，就把它涂在切片上，等待它和目标蛋白质结合。
这个过程就像约会，抗体和蛋白质在切片上“相遇”，彼此结合。
结合得越紧密，后面的结果就越清晰！4. 显色反应4.1 连接二级抗体接下来，我们要用二级抗体来“加油”。
这一步是让我们能看到“结合”的效果。
二级抗体会识别一级抗体，并且带上标记，像给你的队伍加上标志，显得更亮眼。
4.2 显色剂的使用然后，加入显色剂，这一步就像给你的作品上色，瞬间让切片变得活灵活现。
显色剂和标记结合后，就会产生颜色反应，形成我们最终需要的信号。
这时候，你能看到那些特定蛋白质的位置，就像在黑暗中点亮了灯塔。
5. 观察与分析5.1 显微镜观察当颜色形成后，我们就可以用显微镜观察结果了。
免疫组化基本步骤免疫组化是一种研究细胞或组织中特定抗原表达的方法。
它是通过将已知抗原与未知组织或细胞的衍生物进行反应，然后通过可见光或荧光显微镜观察这些抗原的表达情况。
免疫组化的基本步骤如下：1.样本预处理：首先，需要对待检组织样本进行预处理。
这通常包括固定和包埋。
固定可以使用甲醛、乙醇等化学物质进行，目的是保持组织或细胞的形态结构和细胞膜完整性。
接下来，样本通常会被包埋在石蜡或冰冻剂中，以便进行切片。
2.切片制备：将处理后的样本切片。
通常可以使用切片机或超薄切片机将固定好的组织切成薄片，通常为4-10微米。
切片可以更好地展示组织结构和细胞的形态。
3.抗原恢复：根据需要，可能需要进行抗原恢复步骤。
抗原恢复是通过热或酶解的方法，来使抗原的免疫原性恢复。
这是因为在组织固定的过程中，抗原常常会被交联变性，丧失免疫反应性。
4.抗体染色：将待检样本与已知抗体进行反应。
已知抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
这些抗体具有对特定抗原的亲和力。
反应通常在生物素-链霉亲和素体系或酶-抗酶（如辣根过氧化物酶）体系中进行。
通过这些反应，待检抗原会与抗体结合，形成抗原和抗体的复合物。
5.检测标记物：接下来，需要对已形成的抗原-抗体复合物进行检测。
这通常涉及到糖基化酶物质（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记抗体。
检测标记物的选择取决于研究者的需求以及所使用的设备和系统。
6.显色：根据使用的检测标记物不同，需要进行相应的显色步骤。
对于辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶体系，可以使用底物通过化学反应产生颜色信号。
对于荧光标记抗体，可以通过激光或紫外线照射来使其发出荧光光。
7.显微观察：将显色后的样本放置在显微镜下进行观察。
根据待检抗原的位置和表达情况，可以通过显微镜来观察和分析组织或细胞中抗原的分布和表达水平。
免疫组化技术在医学研究和临床诊断中发挥着重要的作用。
它能够帮助研究人员了解组织或细胞中特定抗原的表达情况，从而深入了解疾病的发生机制，并且可以用于辅助诊断和病理分析。
免疫组化操作步骤一免疫组化（法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。
如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 32 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 52 次。
5. 滴加 V ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。
如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。
）6. 缓冲液洗 52 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。
（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 52 次。
9 ．滴加 ( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。
10 ．缓冲液洗 52 次。
11 ．滴加 ( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。
（注：对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。
）12 ．缓冲液洗 52 次。
13 ．向 1 ( 或 ) 中滴加 1-2 滴（或） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。
（具体时间由染色深浅决定。
）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。
二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）、 3 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸馏水冲洗，浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。
滴加一抗工作液， 37 ℃孵育 1-2 小时或 4 ℃过夜。
（ 5 ）、冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 6 ）、滴加适量生物素标记二抗工作液， 37 ℃孵育 10-30 分钟。
（ 7 ）、冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 8 ）、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育 10-30 分钟。
（ 9 ）、冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 10 ）、显色剂显色 3-15 分钟（或）（ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
三. 冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片 4-8 ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10分钟，洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
以下同石蜡切片免疫组化三、免疫组化方法中关键环节及其原理解述（一）酶免疫组化的环1、本固定：固定的目的是①防止本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗结合的类脂，使抗原抗结合物易获得良好的染色结果；③固定的本易保存。
2、脱水、石蜡包埋和片：脱水用梯度乙醇（由低到）充分脱水、对组织完全浸蜡、切片时刀片干净和锋利。
否则，容易裂片和脱片等。
3、脱蜡和水化：这是为了后面的抗等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。
脱蜡可以先60度20，然后立即二甲苯1-3分别10，但当天好的切片可以60度3-4h。
水化用梯度乙醇（由到低）。
若脱蜡和水化不全易出局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
4、抗原修复：由组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提抗原检测率。
常用的修复方法从强到弱一般分为三种，压修复、微波修复、胰酶修复。
修复液也分为若干种（具的可以查阅相资料，大量的：中性的、的等）。
我们实验室一般用微波修复中火6*4次，效果不错。
注意微波修复后自然冷却30左右（只你觉得修复液的温度达室温即可）。
5、细胞通透：目的是使抗能够充分地进入胞内进行结合反应。
一般用 100、蛋白酶k等通透液。
如 100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
在免疫组织化学（>10厚切片）和免疫细胞化学中一般用 100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。
6、灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的法和法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。
灭活内源性一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10左右，而0。
3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或可能好在保抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；用配，配好后4度避光保存。
不过，在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。
7、血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
一般室温或37度10-30。
8、一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重，包括孵育时间和抗浓度。
一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗浓度有，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45。
具条件还摸索。
二抗孵育条件：二抗一般室温或37度301h，具时间需摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还摸索浓度。
但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
9、抗稀释液：其实许多实验室抗稀释液就用一般即可，但专用的抗稀释液中除份外，还加了叠氮化钠防腐剂、稳定剂等组份，对抗的多次回收利用较好。
正为这种原，我一直用国产的专用抗稀释液，一段时间在更换新抗稀释液时实验结果出了阴性结果（提可能一抗没有结合），最后从抗浓度和孵育时间、封闭时间等原排除后，发是新抗稀释液的值偏酸，而使抗原抗反应不佳，终而出假阴性结果。
10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重，我一般在一抗孵育前的清洗是3*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5。
注意：（1）单独冲洗，防止交叉反应造污染。
（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。
我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间足够，才能彻底洗去结合的物质。
（4）的和离子强度的使用和求。
这方面我有惨痛教训，当时我买的抗稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议在7.4-7.6浓度是0.01M。
（中性及弱硷性条件（7-8）有利免疫复合物的形，而酸性条件则有利分解；低离子强度有利免疫复合物的形，而离子强度则有利分解）11、显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由孵育条件决定。
显色时间不是固定的，由显微镜下控显色时间，到出特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；显色时间很短（如几秒或几十秒）就出很深的棕褐色，这很可能说明你的抗浓度过或抗孵育时间过长，需下调抗浓度或缩短你的抗孵育时间；此外，若很短时间就出背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需延长封闭时间；显色时间很长（如超过十几分钟）才出阳性染色，一方面可能说明你的抗浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
12、复染：目的是形细胞轮廓，从而更好地对目蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。
注意苏木素复染时间看当时的室温、溶液的新旧、目抗原的定位等情，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则短。
不过这个如果染色不理想可以补救的。
即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置苏木素中染色即可。
盐酸酒精是分化，氨水是返兰。
作用不同。
片子复染完后流水振洗，然后置盐酸酒精中数秒（一定动作快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。
13、封片：为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液时为止；当发液接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。
（二）免疫荧光方法中的重环1、冰冻切片备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。
选用干净锋利的刀片、组织一定冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10，尤其较长时间保存的白片，一定及时固定和适当保存。
3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。
血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30。
4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重，包括孵育时间和抗浓度。
一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗浓度有，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45。
具条件还摸索。
5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度301h，具时间需摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还摸索浓度，切记避光反应。
但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
最后，荧光素记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需注意配时小包装和并进行适当的离心。
6、复染：目的是形细胞轮廓，从而更好地对目蛋白进行定位。
一般常用复染。
7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。
避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液时为止；当发液接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。
8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重，我一般在一抗孵育前的清洗是3*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5。
注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造污染。
（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。
我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间足够，才能彻底洗去结合的物质。
（4）的和离子强度的使用和求。
这方面我有惨痛教训，当时我买的抗稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议在7.4-7.6浓度是0.01M。
（中性及弱硷性条件（7-8）有利免疫复合物的形，而酸性条件则有利分解；低离子强度有利免疫复合物的形，而离子强度则有利分解9、拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。
使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书求进行操作，不随意改变序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90，超压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；本受紫外线照射3~5后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，本应集中检查，以省时间，保光源。
