二抗的偶联标记

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。

一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。

其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。

为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。

氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。

这里介绍两种程序。

程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。

(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。

(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。

(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。

(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。

(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。

(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。

酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。

*教你如何正确选择二抗通常情况下，某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择，如何能选择到最适合该实验的二抗，需要综合以下几个方面进行考虑：●一抗的物种来源一抗是在什么物种来源的，相应的二抗也要是抗该物种的抗体。

例如，如果一抗是在小鼠体内制备的，那么你就应当选择抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔体内制备的，那么二抗就应当是抗兔的抗体。

至于二抗本身是在什么动物中制备的对二抗的质量并无明显的影响。

●一抗是属于哪个类或亚类二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。

这通常是针对单克隆抗体而言。

多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体.单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗体。

如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。

如果你不知道一抗是哪一类别或亚类，那么抗小鼠IgG是一个不错的选择，因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。

二抗的特异性下面总结了几种具有不同特异性的二抗：针对整个抗体分子（H＋L）具有特异性：如抗IgG(H+L)，此类抗体既可以与抗体的重链结合也可以与轻链结合，即与抗体分子的Fc，F(ab’)2/Fab部分（见图5）均可反应，抗IgG(H+L)也可以与其他免疫球蛋白家族反应（如IgM和IgA），因为所有的免疫球蛋白都具有相同的轻链（kappa链或lambda 链）。

针对Fab片段具有特异性：这类抗体与重链轻链均可以结合，由于它们可以与轻链反应，它们同时也已和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应。

这对Fc片段或重链具有特异性：这类抗体和重链的Fc部分反应，一次它们是类别特异性的（即gamma链特异性抗体只与IgG反应，mu链特异性抗体只识别IgM，依此类推）。

二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，根据实验需求，二抗上通常连有酶或荧光素等标签。

由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以广泛应用，如WB/ELISA/IHC/IP等。

二抗针对某一特定物种的所有抗体均具有特异性，因而使用特定标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。

二抗，广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体。

检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同样的，在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从以下几个方面考虑：1.一抗的种属来源根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。

例如：一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或兔抗小鼠等）。

2.一抗的类别亚型二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。

这通常是针对单克隆抗体而言。

多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。

单克隆抗体的类别及亚型通常会在产品说明书中有描述，如果一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗IgM。

如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚型的二抗。

此种抗体在双标记实验中尤其合适。

3.二抗的偶联标记一般来讲，偶联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP）、荧光基团、生物素、金颗粒等。

选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。

WB、ELISA 和IHC常用的二抗通常是酶标二抗（部分荧光WB需选用远红外波长荧光蛋白标记的荧光二抗），而免疫荧光、流式等实验中通常使用荧光基团标记的二抗，而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。

还有一些需要更大程度地放大信号的免疫实验中，二抗则可以选择biotin/avidin体系的二抗或无偶联标记的二抗（再用三抗放大）。

抗人二抗丨Jackson ImmmoResecarch二抗选择指南血清学检测在临床决策中起着至关重要的作用，免疫分析是目前可用的最强大，最灵敏的血清学检测方法之一，它基于抗原抗体之间的高度特异性结合，即使在低浓度下也能进行定性和定量检测。

当选择用于夹心法检测的抗人二抗时（图1A），需要考虑一抗的种属，并使用与该物种有最小交叉反应的二抗。

尽管免疫测定的功能和目的有所不同，但为了在临床上获得准确，可靠数据，开发血清学试剂盒时，高质量试剂至关重要。

抗人二抗的质量是开发免疫测定试剂盒时的关键考虑因素，二抗需要谨慎选择，因为它们会结合一种一抗的多个表位上，从而增强了信号的灵敏度和选择性。

在免疫分析中选择合适的二抗时的考虑因素以及抗体的特征，Jackson 二抗为例：1.抗体来源：人体样品的血清学检测应使用抗人二抗，以最大程度地减少非特异性结合，以最大程度降低背景信号和假阳性。

Jackson 二抗可以提供多种来源的抗人二抗，包括羊驼，驴，山羊，小鼠和兔子。

2.产品类别：二抗可以是完整的免疫球蛋白（Ig）G，也可以是F（ab'）2和Fab片段，完整的IgG分子可适用于大多数检测，而F（ab'）2和Fab片段可用于避免与具有Fc受体的活细胞的非特异性结合。

Jackson 二抗可以提供完整IgG形式的二抗以及F（ab'）2和Fab片段3.特异性：根据所需免疫测定的特异性，可以制备针对整个Ig分子的二抗，以及针对于Fc 或F（ab'）2结构域特异性的二抗。

Jackson 二抗可以提供针对于对整个人源Ig分子的二抗，以及针对于Fc和F（ab'）2结构域特异性的二抗。

4.亚型：大多数免疫测定均只检测IgG型抗体，这种类型抗体占总血清Ig的?75％，是次级免疫反应的一部分。

但是，血清中同时也存在IgM和IgA，而且二抗只对同亚型一抗的具有特异性。

Jackson 二抗可以提供对IgG，IgM，IgA，IgG+IgM和IgG+IgM+IgA一种或几种亚型有特异性的二抗。

一抗得选择检测任何目得靶蛋白都有不止一种抗体可供选择,为缩小抗体得选择范围选中合适得抗体，需要考虑如下几种因素:分析试验应用得类型ｌ样本蛋白得结构性质l样本得种属ｌ抗体宿主得种类l抗体得标记与检测ｌ1、分析试验应用得类型一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型,如:可以应用于ＷＢＩＨＣIＣC ELASA分析等，如果抗体说明书没有提及得应用类型,并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型,而仅就是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验,则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。

２、样本蛋白得结构性质了解样本蛋白得结构性质有助于选择最合适得抗体，至少两方面因素需要考虑待测样本蛋白得结构域：抗体就是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来,其中得免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体(如:细菌)或细胞,抗体说明书一般都有免疫原得描述,如果打算检测得就是蛋白片断或一种特殊得同型物或蛋白全长得某一区域,则必须选择用含此片段域得免疫原制备出得抗体.如果打算用FACＳ流式检测活细胞得表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白得胞外域来免疫制备得抗体。

l样本得提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如:许多抗体只识别还原与变性得、表位已暴露不受二级四级结构阻碍得蛋白样本,另一方面,某些抗体仅识别天然折叠状态得蛋白。

当选择免疫组化得抗体时，应注意某些抗体只识别未固定得冷冻得组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚得甲醛固定石蜡包埋得组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来ｌ3、样本得物种应选择物种相同或有交叉反应得抗体，抗体可能与不同物种得同种靶蛋白有交叉反应,因其氨基酸序列同源性较高，如果样本得种类未列入抗体说明书上得交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种得蛋白,而只就是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对得方法来预测交叉反应，可应用Ｅxpasy 与ＮCＢI BＬＡＳT来进行不同物种蛋白同源性比对。

抗体的标记在绝大多数情况下，当抗体分子被应用于研究时均需要被标记。

依据实验目的之不同，所采用的标记方法和标记物通常也是不同的。

一、抗体的标记的直接法与间接法（一）直接法直接法是将纯化后的抗体先与一标记物直接结合，然后再与靶分子（抗原）结合，通过检测抗体所携带的标记物来对靶分子（抗原）进行定性、定位、定量测量的方法。

（二）间接法间接法与直接法不同，抗体既不需纯化也不需标记，而是在抗体与相应靶分子（抗原）结合后，洗去未结合抗体，然后通过利用已标记好的第二抗体（二抗）与一抗的结合来间接标记出靶分子（抗原）的存在情况。

此方法带有比直接法更多的标记物，因此较直接法灵敏。

二、标记物的选择无论是直接法还是间接法，标记物的选择至关重要。

表1-2-1所列出的就是一些常用标记物及其相应的检测方法和优缺点等。

表1-2--1 标记物的选择标记物检测方法优点缺点应用生物素与各种标记物偶联的亲和素与链霉亲和素保存时间长，灵敏度高，检测手段多样步骤过多，存在内源性生物素干扰，有些底物对人体有害免疫组化、免疫印迹荧光色素荧光显微镜或荧光计保存时间长，分辨率高自发荧光，易淬灭免疫组化酶底物显色保存时间长，灵敏度高，肉眼直接可见，检测手段多样步骤过多，存在内源性酶的干扰，分辨率低，有些底物对人体有害免疫组化、免疫印迹125I或131Iγ计数仪、放射自显影易于直接标记，灵敏度高半衰期短，对人体有害免疫印迹、定性定量免疫分析生物合成放射自显影、β计数仪不损伤抗体、操作简便半衰期短，敏感性低，需杂交瘤细胞免疫印迹、定性定量免疫分析胶体金显微镜、电镜、肉眼特异性强、灵敏度高、应用范围广、可用于双重和多重标记对试剂、玻璃器皿内的要求极高，标记物浓度较高免疫组化、流式细胞术、定性定量免疫分析第二节免疫组织（细胞）染色技术一、基本概念免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）是用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗原抗体反应和化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。

一抗和二抗的反应原理
一抗和二抗是免疫学研究中常用的实验技术，用于检测特定抗原或抗体的存在及其相互作用。

一抗（Primary antibody）：一抗是与目标分子（抗原）特异性结合的抗体。

它可以是由动物免疫产生的多克隆抗体或单克隆抗体。

当一抗与抗原结合时，它可以激活免疫系统并引起免疫反应。

一抗可以通过间接免疫荧光（IFA）、免疫组织化学（IHC）或免疫印记技术等方法进行检测。

二抗（Secondary antibody）：二抗是特异性地结合在一抗上的抗体。

它可以是与一抗相同物种的抗体（例如，如果一抗是兔多克隆抗体，则二抗可以是兔抗兔抗体），或是其他物种的抗体。

二抗通常标记有某种标志物，如荧光素或酶。

它的作用是增强信号和检测灵敏度，使得目标分子能够更容易地被观察或检测。

反应原理：当一抗与目标抗原结合后，二抗与一抗结合形成免疫复合物。

这种结合通常是通过抗体的特异性识别和亲和力实现的。

在荧光标记的实验中，激发光源会激发荧光素标记的二抗，产生发光信号。

在免疫组织化学或免疫印记技术中，酶标记的二抗会与底物反应产生颜色变化。

这样，通过检测荧光或颜色变化，可以确定目标分子的存在和定位。

总之，一抗和二抗的反应原理是利用抗体的特异性识别和亲和力，通过特异性结合目标分子（抗原）来实现对该分子的检测和定位。

ap标记的二抗显色原理AP（Alkaline Phosphatase）标记的二抗（Secondary Antibody）显色原理是一种常用的免疫组织化学染色方法，用于检测蛋白质、抗原或其他分子在细胞或组织中的表达情况。

AP标记的二抗显色原理主要基于酶学反应和显色反应。

酶学反应通过将AP与二抗结合，将AP引入到靶标物周围，从而作为靶标物是否存在的标志。

显色反应通过在物质分解产物与显色底物之间的化学反应，产生可视化的染色产物。

AP标记的二抗显色原理通常分为两个步骤：免疫反应和显色反应。

一、免疫反应：1. 样品处理：首先，对待测细胞或组织样品进行固定和脱水处理，以保持样品的形态和结构。

2. 抗体处理：将一种特异性的一抗（Primary Antibody）加入样品中，与待检测的抗原或蛋白质结合。

一抗可以与不同抗体结合，例如抗体、抗血清、血清偶联物等。

3. 二抗处理：在一抗结合后，加入AP标记的二抗，与一抗结合在一起。

二抗是与一抗不同动物种源的抗体，可以识别并结合到一抗的Fc区域。

4. 清洗：对待检测样品进行反应过程中的清洗，以洗掉未结合的抗体。

二、显色反应：1. 酶学反应：向样品中加入AP底物，通常为碱性磷酸酶底物，如BCIP（5-溴化-4-氯-3-吲哚-磷酸盐）和NBT（硝基蓝硫酸盐）。

这两种底物在酶促催化下分解为可溶性产物和可沉淀或可溶的有色产物。

2. 显色反应：底物分解产物根据不同的显色机制而产生有色产物，通常为蓝色、紫色或棕色。

产物在组织或细胞中聚集，可直接观察到显色反应的结果。

AP标记的二抗显色原理的优点在于其灵敏度高、稳定性好、显色反应可保留在组织或细胞中，并且可以进行相对定量的分析。

然而，该方法也存在一些局限性，例如显色的结果不够明确、显色时间较长、显色产物在显微镜下不易分辨等。

综上所述，AP标记的二抗显色原理是一种常用的免疫组织化学染色方法，通过酶学反应和显色反应实现对待检测抗原或蛋白质的定位和可视化观察。

FITC标记蛋白质的方法FITC（荧光异硫氰酸酯）是一种常用于标记蛋白质的荧光染料。

FITC 标记蛋白质的方法主要包括化学共价结合和生物亲和结合两种。

化学共价结合是FITC标记蛋白质最常用的方法之一、该方法利用FITC分子中的异硫氰基与蛋白质中的氨基酸侧链上的羟基、胺基、硫醇基等反应，形成稳定的共价键。

常用的化学共价结合方法有直接标记和间接标记两种。

直接标记方法是将FITC直接与蛋白质反应制备成FITC-蛋白质共价偶联物。

该方法简单快速，但容易引起蛋白质的损伤和聚集，从而影响蛋白质的功能和结构。

间接标记方法则采用二步法，在第一步中，将FITC标记到与蛋白质特异结合的二抗上，形成FITC-二抗共价偶联物；在第二步中，该FITC-二抗与蛋白质发生特异性的抗原-抗体反应，从而实现FITC标记蛋白质的目的。

该方法操作简单，不容易损伤蛋白质的结构和功能，因此在很多领域中被广泛应用。

除了化学共价结合，生物亲和结合也常用于FITC标记蛋白质。

生物亲和结合方法利用具有亲和性的结合分子在非共价方式下结合FITC和蛋白质，形成等效标记。

常用的生物亲和结合方法有亲和标记系统、酶标记系统和金标记系统。

亲和标记系统是一种利用富含半化合金属离子的亲合树脂，在存在FITC和蛋白质的条件下实现FITC标记的方法。

该方法在选择亲合树脂时需要考虑其对蛋白质的亲和性、将FITC与蛋白质结合后的稳定性以及标记后的蛋白质能否保持其结构和功能。

酶标记系统是一种利用酶标记物将FITC标记到蛋白质上的方法。

常用的酶标记物有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和逆转录酶等。

该方法对于需要进一步进行酶活性检测或者需要与其他酶标记物共同使用的试验有很大的应用价值。

金标记系统是一种利用金纳米颗粒将FITC标记到蛋白质上的方法。

金纳米颗粒具有很高的表面增强拉曼散射（SERS）信号，可以增加FITC标记物的检测灵敏度。

该方法可以应用于免疫组化检测、免疫荧光显微镜等领域。

荧光标记二抗的选择来源: 生物耗材网发布日期: 2012-2-28一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素。

选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。

对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光标记的二抗。

如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。

其中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种：【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。

FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。

FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。

由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。

FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

然而FITC 的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。

【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长(550, 570, 596nm)和最大发射波长（570, 590, 620nm）。

尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。