植物激活蛋白的分离_纯化及等电点的的测定

第24卷　第4期《新疆师范大学学报》(自然科学版)V ol.24,N o.4 2005年12月Jour nal o f Xinjiang N or mal U niver sity Dec.2005(N atural Sciences Edition)植物激活蛋白的分离、纯化及等电点的的测定仲新华1,　邱德文2,　王纯利1,　刘　铮2(1.新疆农业大学,新疆乌鲁木齐830052;2.中国农业科学院环境与可持续发展研究所,北京,100081)摘要:文章主要介绍首次从真菌中提取的植物激活蛋白是一种高效、多功能、广谱性、能诱导植物对病虫害产生免疫抗性的新型植物诱导物质,通过分离纯化该蛋白,可以为下一步的活性检测,序列测定及基因克隆打下良好的基础。

关键词:植物激活蛋白;离子交换层析;分子筛;等电点中图分类号:　O629.3 文献标识码:　A 文章编号:　1008-9659-(2005)-04-0065-04植物激活蛋白主要通过激活植物体内分子免疫系统,提高植物自身免疫力,通过激发植物体内的一系列代谢调控,促进植物根茎叶生长和提高叶绿素含量,从而达到提高作物产量的目的。

中国农科院环境与发展研究所蛋白质药物工程实验室对其作用机理进行了初步研究,推测其机理可能为:来源于真菌的42-62K D 的一类信号传导分子,可通过不同的代谢途径实现信号传导,引起基因表达,激活植物自身防御系统和生长系统,提高植物自身免疫力,通过调节植物生长代谢系统,促进植物生长,提高作物产量和产品品质。

本实验在分离纯化植物激活蛋白的基础上,采用等电点聚焦电泳测定了该蛋白质的等电点,为进一步得到结晶及研究该蛋白的结构建立了坚实的基础,并对于下一步的活性检测,序列测定及基因克隆具有重要意义。

1　实验材料1.1　A lternaria ap p菌株系中国农业科学院环境与可持续发展研究所蛋白质药物工程实验室保存并提供;1.2　蛋白纯化仪型号A K T A exp lor er10,离子柱是H itrap TM Q FF1ml,H itrap T M DE AE FF1ml,脱盐柱是H itrap TM26/10Desalting5ml,分子筛是Sep hacry lS-100,均为瑞典A mer sham公司产品;等电聚焦仪R oto-f or cell及S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳均为Bid-red公司产品;A micon Ultra10K D超滤管为北京华美公司产品;1.3　低分子量标准蛋白由北京江晨公司提供,其余试剂均为分析纯。

蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的。

本实验旨在通过离子交换色谱法测定蛋白质的等电点，探究蛋白质在不同 pH 条件下的电荷状态变化，进而确定蛋白质的等电点。

二、实验原理。

蛋白质的等电点是指蛋白质在溶液中呈电中性的 pH 值。

在等电点条件下，蛋白质的带电量最小，导致其在电场作用下停止迁移。

本实验采用离子交换色谱法，利用色谱柱对蛋白质在不同 pH 条件下的迁移情况进行监测，从而确定蛋白质的等电点。

三、实验步骤。

1. 将色谱柱连接至色谱仪，并进行平衡处理；2. 取一定浓度的蛋白质溶液，分别调节 pH 值至不同条件下；3. 将不同 pH 条件下的蛋白质溶液加入色谱柱，进行色谱分离；4. 监测蛋白质在色谱柱中的迁移情况，记录不同 pH 条件下的保留时间；5. 根据实验数据绘制蛋白质的等电点曲线，确定蛋白质的等电点。

四、实验数据及结果分析。

通过实验数据处理和分析，我们得到了不同 pH 条件下蛋白质的保留时间，绘制出了蛋白质的等电点曲线。

通过曲线的交叉点，我们可以确定蛋白质的等电点为X。

五、实验结论。

根据实验结果，我们成功测定出了蛋白质的等电点为 X。

这一结果对于进一步研究蛋白质的性质和功能具有重要意义。

六、实验总结。

本实验通过离子交换色谱法测定蛋白质的等电点，取得了较好的实验结果。

然而，在实验过程中仍然存在一些问题，例如实验操作的精度和准确度有待提高。

未来我们将进一步完善实验方法，提高实验数据的可靠性和准确性。

七、参考文献。

1. Smith, A. B., & Jones, C. D. (2017). A review of protein isoelectric focusing: methods, applications, and advances. Critical Reviews in Biotechnology, 37(4), 399-408.2. Wang, L., & Smith, R. (2019). Determination of protein isoelectric point by capillary isoelectric focusing. Journal of Chromatography A, 1601, 132-137.八、致谢。

新型真菌源激活蛋白的分离纯化及生物功能的研究的开题
报告
一、研究背景和意义
真菌是一类重要的微生物资源，其代谢产物具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种活性。

真菌源激活蛋白（FAPs）是一类新型的生物活性蛋白，具有抗肿瘤、抗炎症、免疫调节等多种生物学功能。

FAPs是由真菌生产的一类蛋白质，具有多种活性，但其生物合成机制尚不完全清楚。

因此，我们需要深入研究FAPs的结构和生物活性，为真菌代谢产物的开发和利用提供有力支持。

二、研究目的
本课题的研究目的是通过分离纯化和生物学功能的研究，探索FAPs的结构和生物活性，为其在生物制药、食品添加剂和农业等领域的应用提供理论和实验基础。

三、研究内容和方法
1. FAPs的分离纯化
本次研究将以优良生产菌株为基础，在其代谢产物中筛选出含有FAPs的菌株，并通过分离、纯化提取目标蛋白质。

其中，离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等技术将被运用。

2. FAPs的生物学功能研究
本次研究将采用多种技术手段，如质谱分析、基础生物学试验、免疫学实验、肿瘤模型等，对FAPs的生物学功能进行研究，探索其抗炎、免疫调节、促进细胞增殖和凋亡的生物学作用机制。

四、预期成果和意义
通过本次研究，我们将获取到高纯度的FAPs，探索其结构和生物学功能，为真菌代谢产物的开发应用提供新思路和新途径。

在免疫学、肿瘤学、生物制药等领域，FAPs具有广阔的应用前景，有望成为新型的生物学药物和食品添加剂，在促进人类健康、推动经济发展等方面发挥重要作用。

伞形科植物叶片中蛋白质的分离与纯化及利用SDS-PAGE电泳法测定相对分子质量生物工程09（2）班张翔指导老师：张芬琴（甘肃省河西学院生命科学与工程系734000）摘要：分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定的比例与蛋白质分子结合成为带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决与分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子质量的对数对迁移率所作的标准曲线来求得未知蛋白质的相对分子质量。

关键词：伞形科植物；叶片；蛋白质；分离；电泳法引言:20世纪60年代Shapiro建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性，但对于M r小于10000的蛋白质来说是无能为力的［1］. 20世纪80年代初Sch%26auml;gger等［2］应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质，但分离效果不甚理想且重复性较差.之后他们又进行了系统地研究和摸索，能够分离较大M r范围内的蛋白质.随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出.我们在进行基因工程药物的开发研制中，对SDS-PAGE方法进行了多次改进，在较低的丙烯酰胺浓度下取得了理想的结果.此法所需仪器简单，操作方便，重现性好，时间短，只需微克量的蛋白质便可显带且能迅速估计出其M r，值得进一步推广和利用.材料和方法：1.1试剂Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，30 mM Tris-HCl (pH8.0)9, （含0.1 mM EDTA, 6mM Ascorbic acid，5 mM MgCl2)混匀。

蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的1、了解蛋白质等电点的概念及其重要性。

2、掌握测定蛋白质等电点的基本原理和方法。

3、学会使用酸度计等仪器进行实验操作。

二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会发生解离。

当蛋白质溶液处于某一 pH 值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。

在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。

利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定蛋白质的等电点。

本实验采用醋酸纤维素薄膜电泳法来测定蛋白质的等电点。

醋酸纤维素薄膜具有均一的微孔结构，对蛋白质分子的吸附作用小，电泳时泳动速度快，分辨率高。

在一定的电场强度下，不同 pH 值的缓冲溶液中，蛋白质分子会向与其所带电荷相反的电极方向移动。

当溶液的 pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，泳动速度为零。

三、实验材料与仪器1、材料新鲜鸡蛋醋酸纤维素薄膜巴比妥缓冲液（pH 86、pH 74、pH 64、pH 54）蛋白质染色液（氨基黑 10B）漂洗液2、仪器电泳仪酸度计培养皿镊子剪刀直尺四、实验步骤1、醋酸纤维素薄膜的处理将醋酸纤维素薄膜剪成 2×8cm 的小条，在巴比妥缓冲液（pH 86）中浸泡 30 分钟，使其充分浸透。

用镊子取出薄膜，用滤纸吸干多余的缓冲液。

2、点样用毛细管吸取少量鸡蛋清样品，在薄膜的无光泽面距一端 15cm 处轻轻点样，点样宽度不超过 05cm。

3、电泳将点样后的薄膜光滑面朝下，搭在电泳槽的支架上，两端分别与电泳槽的正、负极相连。

在电泳槽中加入巴比妥缓冲液（pH 86），使薄膜完全浸没在缓冲液中。

接通电源，调节电压为 160V，电泳 40 分钟。

4、染色与漂洗电泳结束后，将薄膜取出，放入氨基黑 10B 染色液中染色 10 分钟。

取出薄膜，放入漂洗液中漂洗数次，直至背景无色，蛋白质条带清晰可见。

5、测定 pH 值分别配制 pH 74、pH 64、pH 54 的巴比妥缓冲液。

植物蛋白质的分离与纯化技术的研究随着人们对健康意识的不断提高，植物蛋白质越来越受到人们的关注，越来越成为了人们日常膳食的重要来源。

而对于植物蛋白质的分离与纯化技术的研究，则是植物蛋白质的生产与应用领域的重要一环。

植物蛋白质的来源植物蛋白质来源广泛，常见的有大豆、花生、黄豆、绿豆、麦芽、麻仁、薏米、玉米、香蕉、南瓜籽等。

其中以大豆和黄豆的蛋白质含量最高，达到40%-50%左右，是植物中蛋白质含量最高的。

植物蛋白质的分离技术植物蛋白质的分离技术就是将混合物中的植物蛋白质与其它物质分离开来的过程。

常用的分离技术有：1.酸碱沉淀法酸碱沉淀法是最早应用于分离植物蛋白质的方法之一。

其原理是通过改变植物蛋白质分子表面电荷，使蛋白质分子发生电荷交互作用而发生沉淀。

这种方法简单易行，但不适合分离提纯众多种植物蛋白质。

2.离子交换法离子交换法是利用离子交换树脂对植物蛋白质的分离。

树脂表面活性基与待分离物质进行离子交换，从而达到有效分离的目的。

3.凝胶层析法凝胶层析法是将柱子内填充凝胶物质，利用分子尺度的分子筛效应，按照蛋白质分子质量大小对待分离物进行层析。

这种方法能同时分离多个蛋白质，但对柱子填充材料的筛选和封装要求较高。

4.尿素溶液电泳法尿素溶液电泳法是利用电力场，将待分离物按照蛋白质分子重量大小进行的分离技术。

在开发初期实验条件比较苛刻，但目前已经被广泛应用于植物蛋白质的分离和纯化。

植物蛋白质的纯化技术植物蛋白质的纯化技术是在植物蛋白质分离的基础上，采用不同的技术手段，进一步提高待分离蛋白质的纯度。

常用的纯化技术有：1.逆流层析法逆流层析法是基于分子互作原理，让电荷相同的蛋白质在酸性或碱性介质中相互作用而成复合物，并进一步进行的分离纯化技术，适用于高水平的纯化要求。

2.氨基酸分析法氨基酸分析法是将待分离物质进行酸水解，分离得到分解后的氨基酸，并通过氨基酸组成的分析，进行分离纯化的技术。

3.种子赋形法种子赋形法，是指将蛋白质进行特殊结构处理，以实现蛋白质的纯化技术。