酶联免疫斑点技术介绍

酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。

该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。

ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。

具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。

2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。

3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。

4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。

5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。

6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。

ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。

它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。

此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。

ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。

此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。

总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。

随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。

固相酶联免疫斑点技术固相酶联免疫斑点技术，听起来是不是有点高大上？它就是个帮助我们检测各种物质的好帮手。

想象一下，你在厨房里做饭，随手把各种调料都放进锅里。

这个技术就像是把你的调料品分类，帮你找出锅里究竟有什么。

很酷吧！不过，咱们今天不聊做饭，而是来聊聊这个小家伙。

固相酶联免疫斑点技术，咱们可以把它简称为ELISAD。

这个名字虽然长得像外星人，但它的原理其实非常简单。

就像你在学校里做的实验，往显微镜底下看看细胞。

它利用了一种叫抗体的东西，专门识别目标物质。

你可以把抗体想象成个非常挑剔的朋友，只有看到自己喜欢的东西才会欢呼雀跃。

哦，对了，这个过程可有趣了，简直就像在举办一场盛大的聚会。

你知道吗，这个技术的关键在于“固相”这个词。

也就是说，它需要把目标物质固定在某个地方。

就像钉子钉在墙上一样，稳稳当当地呆在那里。

这样一来，抗体就能方便地找到它们的“朋友”，然后通过一系列反应，给你展示结果。

简直像是一场寻宝游戏，越找越有趣。

再说说检测的过程。

想象一下，你的朋友们都来了，大家一起来参加这个聚会。

每个人都有自己的名字，抗体的名字就是它们识别的目标。

如果你想知道锅里有多少盐，抗体就像个侦探，带着放大镜一一查看。

检测出来的结果，就像是聚会结束后的成绩单，让你一目了然。

哇，真是个聪明的办法！而且这个技术的应用范围可广了，简直是无所不能。

医学、环境监测、食品安全，哪儿都能看到它的身影。

比如，检测血液里的病原体，确保咱们的身体健康。

这就像是找个医生给你做体检，提前发现问题，早早处理。

谁不想健康长寿呢？想想看，等你老了，还能和孙子孙女一起追逐打闹，那多好啊！说到这里，不得不提一下，固相酶联免疫斑点技术还有个好处，就是操作相对简单。

没那么复杂，就像做个蛋炒饭，火候掌握得当，就能出奇迹。

它不需要太多设备，就像是家里简单的厨具，也能搞定一桌好菜。

快速的反应时间也让它在急诊和研究中倍受青睐。

想想看，当你急需结果时，它能像闪电一样给你答案，真是太贴心了！技术再好也难免有些小缺陷。

酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。

下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。

一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。

- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。

- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。

- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。

- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。

- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。

- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。

2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。

- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。

二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。

- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。

- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。

- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。

2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。

3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。

- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。

4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。

- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。

5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。

酶联免疫斑点技术-回复酶联免疫斑点技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用于测定抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验方法。

本文将详细介绍ELISA的原理、步骤和应用。

一、ELISA的原理ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性相互作用。

ELISA通常使用多孔板作为试剂的固相载体，先在孔板上固定特定抗原或抗体，再根据需要加入待测样品和检测抗体。

通过特异性抗原-抗体反应的信号产生，可以对待测物进行定量或定性分析。

ELISA有两种基本的原理：直接ELISA和间接ELISA。

1. 直接ELISA：直接ELISA是利用特异性抗体与待测物发生直接的非共价相互作用。

在这种方法中，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。

如果待测物包含目标抗原，它将与特异性抗体结合，并固定在多孔板上。

然后，加入适量的检测抗体，该抗体被标记有一种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）。

最后，加入合适的底物，当酶与底物反应时，也就是产生了颜色，可以通过酶促反应的信号强度来确定待测物的浓度。

2. 间接ELISA：间接ELISA是通过待测物与特异性抗体结合，然后再加入检测抗体与该复合物结合。

首先，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。

如果待测物中含有目标抗原，它将与特异性抗体结合并固定在多孔板上。

然后，在充分洗涤去除未结合的物质后，加入标记有检测抗体的二抗。

这些二抗一般与小鼠、兔子等动物蛋白特异性抗体结合，并与待测物-抗体复合物发生特异性反应。

最后，如同直接ELISA，加入适当的底物来检测酶促反应。

以上是ELISA技术的两种基本原理，根据待测物的特性和实验需求，可以选择合适的方法进行分析。

二、ELISA的步骤ELISA方法通常包括固相处理、解离、检测抗体的加入、洗涤、底物发色反应和测定等步骤。

1. 固相处理：将特异性抗体固定在多孔板上。

根据需要，可以使用直接ELISA或间接ELISA的原理选择适合的抗体。

酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。

该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。

该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。

二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。

另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。

同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。

在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。

第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。

第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。

常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。

通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。

此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。

需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。

一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。

总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。

斑点酶联免疫吸附试验原理斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）：从表面到内部的探索1. 什么是斑点酶联免疫吸附试验？•斑点酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用于检测肿瘤抗原、感染性疾病、药物残留等的生物学分析技术。

•ELISA利用酶标记抗体与待测物相互作用，并通过最终的酶反应产生可见的颜色变化，从而定量或定性分析目标物质的存在和浓度。

2. ELISA的原理与步骤原理概述•ELISA利用了抗体与抗原之间的高度特异性反应，实现对目标物质的检测。

•一般的ELISA试验分为直接ELISA、间接ELISA、间接竞争ELISA 和竞争ELISA四种常见形式。

步骤详解1.试样处理与包被：待测样品中的目标物质与特异性抗体结合，形成目标物-抗体复合物。

2.洗涤：将未结合的其他物质洗去，保证后续反应的准确性。

3.二抗添加：加入与目标物-抗体复合物反应的次级抗体，次级抗体通常与酶分子偶联。

4.洗涤：去除未结合的次级抗体，减少背景干扰。

5.底物添加：加入酶底物，与酶发生反应后会呈现可见的颜色变化。

6.反应停止：通过添加反应停止剂停止酶反应，停止颜色的发展过程。

7.读数与结果分析：使用光谱仪或光密度计读取样品的吸光度或荧光强度，并根据标准曲线计算待测样品中目标物质的浓度或定性判断。

3. ELISA的优势和应用领域•高灵敏度和特异性：ELISA可以检测目标物质的微量浓度，并在复杂样品中准确鉴定。

•定量和定性分析：根据标准曲线，ELISA可以定量测定待测样品中目标物质的浓度，也可用于定性判断目标物质的存在与否。

•广泛应用于医学、农业和生物科学等领域：ELISA在肿瘤学、感染性疾病诊断、食品安全监测等方面有着重要的应用价值。

4. 总结•斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见且广泛应用于生物学研究和临床诊断的生物分析技术。

•ELISA通过抗体的高度特异性与目标物质之间的相互作用，结合酶标记技术实现对目标物质的检测和分析。

酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。

该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。

2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。

它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。

该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。

3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。

首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。

步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。

通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。

步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。

步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。

步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。

常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。

步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。

斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。

4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。

这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。

酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。

常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。

ELISpot检测技术操作要求及质量控制作者：刘佳来源：《兽医导刊》 2017年第9期酶联免疫斑点检测技术(enzyme-link immunospot assay，ELISpot) 是近年来发展起来的检测细胞因子免疫学检测技术，是在酶联免疫吸附技术(ELISA) 基础上与细胞培养技术充分结合而建立起来的一种可以在体外检测单细胞水平培养的特异性抗体分泌细胞的新型检测技术，此技术可以快捷、简便的对细胞因子分泌量进行定量，目前已经成为国际公认的抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术。

由此可以预见，该检测方法在动物免疫研究领域将会得到广泛应用，发挥其重要作用。

但是，此项技术尚未形成标准化，对细胞含量、细胞浓度、孵育、显色时间等优化条件还没有形成完整体系。

因此，在检测工作实践中，总结实验操作步骤注意事项，提高检测水平，对提高ELISpot技术检测的准确性以及对各个因素进行优化，建立稳定的检测体系具有重要意义。

一、细胞质量控制1. 采血。

选取45 ～ 50 日龄，没有疫苗接种经历的仔猪，从前腔静脉采集外周静脉血，保证无菌操作，抗凝剂抗凝。

采血后轻摇，使血液与抗凝剂充分混匀，避免出现血凝块，影响分离效果。

震荡过于剧烈或保存不当，会出现溶血现象。

2. 淋巴细胞分离。

6 h 内进行外周血单个核细胞(PBMC) 的分离，时间过长会影响活细胞数，淋巴细胞的活细胞比例直接影响酶联免疫斑点的形成。

将稀释好的细胞悬液沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液液面上，2 000 转/ 分钟离心10 min，转速不宜过高，否则会使细胞壁破裂。

离心后，离心管中由上至下细胞分为四层，即血浆或者组织匀浆液层、环状乳白色淋巴细胞富集层、透明分离液层、红细胞层。

吸出中间环状乳白色PBMC 富集层，吸取方法可以将组织匀浆层用吸管去掉，将乳白色淋巴细胞吸出，也可以直接将吸管插入淋巴细胞富集层吸出。

吸液要慢、稳，避免吸出红细胞。

洗涤后，如果有红细胞存在，可以使用红细胞裂解液，将红细胞去除。

酶免疫技术：分类及应用
酶免疫技术是许多生化分析和医学诊断中重要的一种工具。

它基于抗原与抗体间的特异性反应，将酶标记的抗体或抗原作为探针，通过检测其酶反应产物来检测并定量目标分子。

酶免疫技术种类繁多，主要分为以下几类：
1.酶联免疫吸附测定法(ELISA)
这是一种常用于诊断感染性疾病、肿瘤和免疫相关疾病的方法。

它利用酶标记的抗体或抗原作为探针，检测血清、尿液、唾液等生物样品中的分子。

ELISA可以快速、准确地检测出细菌和病毒感染的抗体和抗原，是一种常见的诊断方法。

2.免疫斑点法
由于其简单和方便的特点，这种技术常用于检测微透镜膜穴、肺结核和疱疹病毒的感染。

免疫斑点法也可用于检测各种细胞因子，如白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-γ等。

3.免疫层析技术
免疫层析技术也称为免疫固相卡，利用固相化学材料吸附抗体或抗原，将它们与待测分子结合，从而完成检测。

该技术可以快速完成检测，广泛用于检测激素、蛋白质等分子结构查询。

4.F快速诊断技术
该技术可用于基于解离测试的负压移位检测，可检测多种微生物、各种传染病以及不同种类的癌症。

快速诊断技术可以快速、准确地检测出更多感染疾病的标记分子，是一种非常灵敏的定量技术。

酶免疫技术已经广泛应用于医学诊断、药物开发和基因工程。

通过不同的酶免疫技术，可以检测、分析和探索多种分子的生物学特性，有助于促进科学研究和临床医学的进步和发展。

ELISPOT酶联免疫斑点分析ELISPOT 技术简介随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。

在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测体液中游离的细胞因子（CK ）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。

80 年代，国外的科研工作者根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT ）。

因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。

ELISPOT 法源自ELISA ，又突破传统ELISA 法，是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。

两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：•ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

•ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过德国AID的ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。

（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）•由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20 万-30 万细胞中检出1 个分泌该蛋白的细胞。

•捕获抗体为BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

ELISPOT 检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。

细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。

酶联免疫斑点技术介绍(总19页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。

它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。

其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。

该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。

在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。

这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。

其二，单细胞水平，活细胞功能检测。

ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。

在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。

其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。

ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。

按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。

实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。

（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。

）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。

在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。