酶联免疫斑点检测技术研究进展

酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。

该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。

ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。

具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。

2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。

3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。

4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。

5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。

6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。

ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。

它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。

此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。

ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。

此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。

总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。

随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。

酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。

该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。

该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。

二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。

另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。

同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。

在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。

第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。

第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。

常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。

通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。

此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。

需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。

一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。

总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。

酶联免疫法在农产品质量安全检测中的应用研究进展酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种广泛应用于农产品质量安全检测中的生物技术方法。

它通过利用抗原与特异性抗体的结合来检测目标物质的存在和浓度。

酶联免疫法在农产品质量安全领域的应用研究一直处于不断发展的状态，下面将对其在不同农产品中的应用进展进行简要综述。

在农产品的有害微生物检测中，酶联免疫法是一种简便、快速、敏感和特异性较高的方法。

鲜活水果和蔬菜中常常会存在大肠杆菌和沙门氏菌等致病微生物的污染，这些微生物会引起食物中毒，威胁消费者的健康。

研究者通过制备适当的抗体，可以将酶联免疫法用于检测这些致病菌的存在和浓度。

通过 ELISA 可以在短时间内迅速筛测出微生物污染，并为农产品的质量安全提供及时保障。

在农产品的农药残留检测中，酶联免疫法也发挥了重要作用。

农药的过量使用或残留会对农产品和环境造成不良影响，对农产品中农药残留的监测和控制成为质量安全的重要环节。

酶联免疫法通过制备特异性抗体，可以快速、精确地检测农产品中的农药残留。

研究者利用酶标抗体的高特异性和敏感性，可以实现对不同种类农药残留的同时检测，极大地提高了检测效率。

在农产品的转基因成分检测中，酶联免疫法也有很高的应用潜力。

转基因农产品是通过基因工程技术将外源基因导入到作物中，以改善其特性或产量。

转基因农产品引起了广泛的争议，需要对其安全性进行严格的监管和检测。

酶联免疫法可以通过特异性的抗体对目标转基因成分进行筛查和定量分析，能够准确地检测转基因农产品的各种成分，以及评估其对人体健康和环境的潜在影响。

酶联免疫法在农产品质量安全检测中的应用研究进展丰富多样。

不仅可以应用于有害微生物、农药残留和转基因成分等的检测，还可以结合其他技术方法进一步提高检测的灵敏性和准确性。

随着科学技术的不断发展，酶联免疫法在农产品质量安全领域的应用前景将更加广阔。

酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。

该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。

2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。

它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。

该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。

3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。

首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。

步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。

通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。

步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。

步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。

步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。

常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。

步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。

斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。

4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。

这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。

酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。

常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。

结核感染T细胞斑点试验技术进展及现状分析结核病是公共卫生中的一种常见传染性疾病，其在传染性疾病致死中所占的比重一直比较高，也是公共卫生需要长期关注的疾病。

结核病在临床上主要表现为咯血、咳痰、肺部空洞等症状，具有不易控制、易复发、具有发病率高、耐药率高等特点，严重影响患者的生活质量，也对人口生命健康危害极大，故早期进行准确鉴别诊断，指导临床治疗，对改善患者预后具有重要意义[1-2]。

痰培养结核分枝杆菌是临床诊断结核病的“金标准”，但存在检测时间较长、结核细菌生长缓慢、对于技术人员要求较高等不足，不利于早期诊断，难以满足临床需要。

结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)属γ干扰素释放试验类型，是诊断肺结核的重要途径，其采取特异性结核分枝杆菌抗原，当前在临床上得到广泛使用[3]。

现就该项目技术进展及现状报道如下：1结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）原理和特点1.1 γ干扰素释放试验（IGRA）简介目前用于临床γ干扰素释放试验（IGRA）主要有两种，一种是QFT-GIT试验，该试验采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测结核特异性抗原刺激致敏T细胞释放γ干扰素浓度。

另外一种就是结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB），该试验的方法是采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测外周血结核特异性抗原刺激分泌IFN-γ的Ｔ淋巴细胞数量[4]。

IGRA已有20多个国家发布了应用指南[5],2014年中华医学会结核病学分会和《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会组织相关专家发布了《γ干扰素释放试验在中国应用的建议》，对IGRA在活动性结核病及潜伏性结核（LTBI）诊断的应用建议。

2017年卫健委发布卫生标准WS288-2017《肺结核诊断》中将γ干扰素释放试验（IGRA）阳性作为结核病诊断实验室检查项目。

卫健委于2020年4月2日发布的《中国结核病预防控制工作技术规范》中明确结核潜伏感染检测方法、人群及预防性治疗方案。

目次前言 (Ⅱ)1 范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 术语和定义 (1)4 检样要求 (1)5 检疫方法 (1)5. 1群体检疫......................................................................................................１5.1.1免疫核实......................................................................................................１5.1.2现场检查......................................................................................................１5. 2 流行病学调查................................................................................................１5. 3 解剖检查......................................................................................................１5. 4 病理学检查 (2)5. 5 病原电镜检查 (2)5. 6 免疫学检验 (2)5.6.1 斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) (2)5.6.2葡萄球菌A蛋白协同凝集试验（SPA-COA） (2)5.7逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 (2)6 无害化处理 (2)附录A （规范性附录）流行病学调查 (3)附录B （规范性附录）斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) (4)附录C （规范性附录）葡萄球菌A蛋白协同凝集试验（SPA-COA） (5)附录D （规范性附录）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 (6)参考文献 (8)前言本标准的附录A、附录B、附录C、附录D为规范性附录。

免疫斑点试验的实验报告实验目的：本实验旨在通过免疫斑点试验（ELISPOT）评估特定抗原刺激下，免疫细胞分泌特定抗体或细胞因子的能力。

免疫斑点试验是一种常用的细胞免疫反应检测方法，广泛应用于疫苗开发、免疫诊断和免疫治疗研究。

实验原理：免疫斑点试验是基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理发展而来，通过检测细胞因子或抗体在固相上的沉积形成斑点，从而定量分析免疫细胞的分泌活性。

当免疫细胞被特定抗原激活后，它们会分泌细胞因子或抗体，这些分子可以被特定的捕获抗体固定在固相上，随后通过酶标记的检测抗体和底物显色，形成可见的斑点。

实验材料：1. 96孔多孔板2. 细胞培养基3. 特定抗原4. 捕获抗体5. 酶标记的检测抗体6. 底物溶液7. 细胞计数器8. 免疫细胞（如外周血单核细胞）9. 其他必要的试剂和耗材实验方法：1. 将96孔多孔板预先涂覆捕获抗体，封闭未结合位点。

2. 将免疫细胞以适当浓度接种到多孔板中，并加入特定抗原进行刺激。

3. 细胞培养一定时间，使细胞因子或抗体分泌并固定在固相上。

4. 移除培养上清，用洗涤液清洗多孔板，去除未固定的细胞和抗原。

5. 加入酶标记的检测抗体，孵育后再次洗涤。

6. 加入底物溶液，使酶催化底物产生颜色反应。

7. 颜色反应达到适宜程度后，终止反应，使用ELISPOT分析系统计数斑点。

实验结果：实验结果显示，不同浓度的抗原刺激下，免疫细胞产生的斑点数量有显著差异。

高浓度的抗原能显著提高斑点的数量，表明免疫细胞对抗原的反应性增强。

通过比较实验组和对照组的斑点数量，可以评估免疫细胞的活性和分泌能力。

实验讨论：本实验结果表明，免疫斑点试验是一种灵敏且特异的方法，能够定量分析免疫细胞对特定抗原的反应。

斑点的数量与免疫细胞的活性成正比，可以用来评估免疫应答的强度。

此外，通过优化实验条件，如细胞浓度、抗原浓度和培养时间，可以进一步提高实验的准确性和重复性。

实验结论：免疫斑点试验成功地评估了免疫细胞对特定抗原的反应性，为进一步研究免疫细胞的功能和免疫应答机制提供了可靠的实验数据。

ELISPOT酶联免疫斑点分析ELISPOT 技术简介随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。

在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测体液中游离的细胞因子（CK ）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。

80 年代，国外的科研工作者根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT ）。

因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。

ELISPOT 法源自ELISA ，又突破传统ELISA 法，是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。

两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：•ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

•ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过德国AID的ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。

（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）•由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20 万-30 万细胞中检出1 个分泌该蛋白的细胞。

•捕获抗体为BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

ELISPOT 检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。

细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。