茅苍术多糖的分离纯化及组成分析
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收稿日期:2006208218; 修订日期:2006212218基金项目:江苏省自然科学基金项目(No .BK2004062)作者简介:段国峰(19682),男(汉族),江苏泰兴人,现任中国药科大学高职院讲师,硕士学位,主要从事中药有效成分研究工作.茅苍术多糖的分离纯化及组成分析段国峰1,欧阳臻2,余伯阳3(1.中国药科大学高等职业技术学院,江苏镇江 212003;2.江苏大学药学院,江苏镇江 212013;3.中国药科大学中药学院,江苏南京 210038)摘要:目的对茅苍术多糖的提取、分离纯化和单糖的组成进行了分析。
方法茅苍术经热水提取乙醇沉淀得多糖粗品(AP W ),AP W 经脱蛋白、透析、DE AE -纤维素柱和Sephadex G -100柱层析进行纯化,纯化多糖通过色谱等方法进行分析。
结果粗多糖主要含AP W 1,AP W 2,AP W 3,AP W 4四个组分。
结论纯化多糖经高效凝胶色谱、薄层层析、气相色谱等分析得知:AP W 1分子量约为5.3×103,由Rha,A ra,Xyl,Man,Glu,Gal 组成,其摩尔比为0.16:0.17:0.24:0.55:0.89:1.00;AP W 2分子量约为5.4×104,由A ra,Man,Gal 组成,其摩尔比为0.82:1.00:0.32;AP W 3、AP W 4分子量约为7.0×105,2.0×106,均由Rha ,A ra,M an,Gal 组成,其摩尔比分别为0.24:1.00:0.48:0.53及0.22:0.34:1.00:0.58;为茅苍术多糖的进一步研究提供了基础。
关键词:茅苍术; 多糖; 分子量; 组分中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:100820805(2007)0420826203Separa ti on,Pur i f i ca ti on and Com positi on Ana lysis of Polys acchar i des Fro m Rh i zom es of A tractylodes lancea (Thunb .)DCDUAN G uo 2feng 1,OUY ANG Z hen 2,Y U B o 2yang3(1.A ltitude V ocational School ,China Pharam aceutical U niversity,Zhenjiang,J iangsu 212003,China ;2.B iol 2ogy and Environm en t School,J iangsu U niversity,Zhen jiang,J iangsu 212013,Ch ina ;3.School of ChineseM ate 2ria M edica ,China Pha ram aceutical U niversity,N anjing,210038,China )Abstract:O bjecti ve To purify and analyse the polysaccharides fr om rhizomes of A tractylodes lancea DC .M ethods The crudepolysaccharides (AP W )were obtained by extracting with hot water and p reci p itating with alcohol .The cleared AP W were purified by DE AE -cellul ose,Sephadex G -100colu mn,and it was analyzed by chr omat ography .Results The purified four p r oteins (AP W 1～4)were re moved fr om crude polysaccharides .Conclusi on Analsed by HPGC,T LC and GC,the molecular weight ofAP W 1～45.3×103,5.4×104,7.0×105and 2.0×106,res pectively .The chem ical components and the molar rati o showed as f oll ows:AP W 1:Rha ∶A ra ∶Xyl ∶Man ∶Glu ∶Gal =0.16:0.17:0.24:0.55:0.89:1.00;AP W 2:A ra:M an:Gal =0.82:1.00:0.32.The component AP W 3and AP W 4were Rha,A ra,Man and Gal,the molar rati os showed 0.24:1.00:0.48:0.53and 0.22:0.34:1.00:0.58.A ll these work can establish foundati on for the further study of A tractyl odes Polysaccharides .Key words:Rhizomes of A tractylodes lancea (Thunb .)DC; Polysaccharides; Molecular weight; Component 中药茅苍术为菊科植物茅苍术A tractylodes lancea (Thunb .)DC .的根茎。
始载于《神农本草经》,列为上品,性温,味辛、苦,归脾、胃、肝经,具有燥湿健脾、祛风散寒、明目的功效,主要用于脘腹胀满、泄泻、水肿、脚气痿躄、风湿痹痛、风寒感冒、夜盲等症。
主产于江苏句容、镇江、湖北襄阳、河南桐柏等地,江苏茅山地区是茅苍术地道药材的中心产区。
关于茅苍术的研究,近年来主要集中在其挥发油等挥发性成分的化学及药理的研究[1～3];对于茅苍术水溶性成分多糖的研究,仅见K .-W.Y U 等[4～6]对湖北产的茅苍术作了研究,研究表明茅苍术多糖具有肠免疫活性、抗假丝酵母菌感染等药理作用,活性与多糖中阿拉伯半乳糖及半乳糖醛酸性部位有关;而对传统地道药材江苏茅山地区茅苍术多糖的研究,国内外未见报道。
本文报道了江苏茅山地区茅苍术多糖的提取纯化及组成研究,药材脱脂后经水提、醇沉,经DE AE -纤维素和Sephadex G -100柱层析得到AP W 1～4四个多糖组分,并经高效凝胶色谱、薄层色谱和气相色谱等分析确定茅苍术多糖的分子量及单糖组成,为进一步研究其化学结构和生物活性提供了依据。
1 材料与仪器1.1 材料与试剂茅苍术采集于江苏句容茅山地区,经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为菊科植物茅苍术A tractylodes lancea(Thunb .)DC .的根茎。
干燥后,粉碎,过50目筛,备用。
DE AE 纤维素(W hat m an 公司)、Sephadex G -100、分子量标准品葡聚糖Dextran 系列、单糖标准品(Sig ma 公司),其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器JAS CO LC1500高效液相色谱系统,日本分光公司;TSK -G4000P W ,日本T OS OH 公司;Avatar360傅立叶红外光谱仪,美国尼高力公司;GC -14B 气相色谱仪,日本岛津公司;N2000色谱处理工作站,浙江大学智能研究所;紫外可见分光光度计,上海优尼科公司;恒流泵、自动分部收集器(上海沪西仪器厂);冷冻干燥机,德国Christ 公司。
2 方法2.1 茅苍术粗多糖的提取取粉碎后的茅苍术(500g ),用无水乙醇回流脱脂,残渣通风晾干后加5000m l 蒸馏水,90℃提取4次,合并提取液,减压浓缩至一定体积。
冰浴条件下加三氯乙酸脱蛋白,离心除去变性蛋白,上清液迅速用Na OH 中和至pH =7.0,浓缩至适量,透析除去小分子杂质,再减压浓缩,加4倍体积的95%乙醇,4℃放置过夜,离心收集沉淀,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,挥干乙醚后,复溶于水,冷冻干燥。
即得水提粗多糖AP W 。
2.2 AP W 分离纯化取AP W 加水溶解,以DE AE -52纤维素柱(50c m ×2.6c m )析层析,依次用0.00～2.00mol/L 的NaCl 溶液洗脱,分别收集洗脱液(每管10m l ),以改良的苯酚2硫酸法[7]跟踪检测,根据洗脱曲线收集。
取0.02～0.20mol/L 的NaCl 溶液洗脱部分,蒸馏水透析3d,冷冻干燥,再经Sephadex G -100柱层析(60c m ×1.0c m )层析,0.1mol/L NaCl 洗脱,以改良的苯酚2硫・628・时珍国医国药2007年第18卷第4期L I SH I ZHEN MED I C I N E AND MATER I A MED I CA RESEARCH 2007VOL.18NO.4 酸法跟踪测定,根据洗脱曲线收集,并经HP LC 凝胶柱检测,得到较为纯化的茅苍术多糖AP W 1,AP W 2,AP W 3和AP W 4。
2.3 茅苍术多糖的分子量测定色谱条件:JASCO R I -1530示差检测器,JASCO P U -1580泵,TSK -G4000P W 色谱柱,柱温30℃,流动相0.003mol/L 醋酸钠,流速为0.5m l/m in 。
2.3.1 标准曲线的制作分别称取平均分子量为2000,500,70,40,10k Dal 的Dextran 系列标准葡聚糖5.0mg,用1m l 流动相溶解,0.45μm 滤膜过滤后,吸取20μl 注入高效液相色谱中,以分子量的对数为纵坐标,以各糖的保留时间为横坐标,绘制标准曲线。
2.3.2 样品分子量测定取纯化后的样品各5mg 与1m l 流动相溶解,按与Dextran 标准品相同的色谱条件操作,求得各自相应的保留时间,按标准曲线计算分子量。
2.4 茅苍术多糖组成单糖的组分分析2.4.1 红外色谱分析分别称多糖各1mg 干燥样品,与K B r 研磨混合后压片,采用Avatar360红外光谱仪扫描分析,波长范围为4000～400c m -1,尤其观察800～900c m -1的吸收峰。
2.4.2 多糖的水解取AP W 1,AP W 2,AP W 3和AP W 4各5mg 干燥样品,加入2.0mol/L 的H 2S O 4溶液0.5m l,封管,100℃水解12h,取出,加入BaCO 3中和,3000r/m in 离心除去BaS O 4沉淀,上清液冷冻干燥,供分析用。
