第八届全国大学生化学实验邀请赛实验试题3
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选手编号：
实验试题 3
华法林（Warfarin）的制备、纯化及谱图解析
一．实验内容：
1.重结晶：以乙醇-水为溶剂重结晶4-羟基香豆素并测定其红外光谱。
2.华法林制备：以4-羟基香豆素（可用自己纯化的，也可直接使用纯品）和亚
苄基丙酮为原料制备华法林（Warfarin），用快速柱层析法分离纯化所得产物。
3.解析谱图。
二．注意事项：
1.实验时间为8:00-16:00，时间到即停止实验，按监考老师要求进行必要收尾
工作后离开实验室。
2.TLC板每人使用最多不超过10块。
3.快速柱层析操作方法见附录1。
4.实验前请仔细检查仪器设备，如遇有问题，请及时向监考人员报告。
5.实验过程请注意安全，应戴上防护眼镜，必要时可使用乳胶手套。
6.废弃物应投放于指定容器内，有机和无机废液请分别倒入贴有对应标签的废
液桶。
7.实验记录和所有数据应按要求记录在实验报告纸指定位置，记在其它位置无
效。
所有读数记录及数据均要监考老师签字认可；若出现造假行为将取消成绩。
8.实验结束时，请将产品、实验报告、试题交给监考老师，并清洗所用仪器（不
计时），整理台面，经监考教师签字后方可离开。
三．主要试剂，仪器及材料
1.实验试剂
4-羟基香豆素（反应用化学纯，重结晶用杂质含量<5%的粗品），亚苄基丙酮（C.P.），TEBA（C.P.），无水乙醇（A.R.），乙醚（A.R.），二氯甲烷（A.R.），无水硫酸钠（A.R.），正己烷（A.R.），乙酸乙酯（A.R.），饱和食盐水，硅胶（300~400目和100~200目），石英砂，华法林样品溶液，柱层析用洗脱剂。
2.实验仪器及材料：
✧实验仪器（每人一套）
实验台柜子中
茄形瓶（25 mL 1个、50 mL 1个、100 mL 2个），量筒（50 mL 1个、
10 mL 2个），球形冷凝管（1根），分液漏斗（60 mL 1个），具塞锥形瓶
（50 mL 1个），锥形瓶（250 mL 1个），烧杯（50 mL、150 mL、250 mL 各1个），玻璃漏斗（1个）、加料漏斗（1个），玻璃棒（1根），不锈钢刮刀（1根），药勺（1个），培养皿（1个），空心塞（14# 2个），胶头滴管（2根），抽滤瓶和布氏漏斗（1套），镊子（1把）
公用台上
层析柱（直径2 cm）（1套，含：层析柱、储液球、两通、加压球），试管架（1个），试管（20根，已清洗并干燥），层析缸
实验台上和抽屉里
磁力加热搅拌器（1台），磁子（2个），油浴锅（1个），铁架台（1个），十字夹和烧瓶夹（4套），铁圈（1个），塑料瓶托（1个），剪刀（1把），升降台（大、小各1个），橡皮管（1根），水浴锅（1个）
公用仪器：
电子天平（精度0.01、0.001各1台），烘箱，旋转蒸发仪，循环水泵
✧其它实验用品
硅胶板，紫外灯，电吹风，铅笔，点样毛细管，一次性滴管，橡皮筋，凡士林，橡皮圈，乳胶手套，线手套，沸石、棉花等，称量纸，滤纸，面巾纸，碎冰
四．有关物质的性质
五．实验原理
华法林（Warfarin）又名苄丙酮香豆素、可迈丁或灭鼠灵，是一种抗凝血素，医疗上用于预防或治疗静脉血栓及其延伸和肺栓塞，预防或治疗心房颤动或与心脏瓣膜置换关联的血栓并发症。
华法林还可用于防止鼠害，是第一代抗凝血杀鼠剂。
本实验通过4-羟基香豆素与亚苄基丙酮在水相中发生Michael加成反应制备华法林，并用快速柱层析分离纯化产物。
反应式如下：
华法林
六．实验步骤
1.重结晶法纯化4-羟基香豆素
以乙醇-水为溶剂重结晶1.0 g 4-羟基香豆素粗品（溶剂须过量50%）。
重结晶所得产品经抽滤、洗涤，置于80 o C烘箱干燥，计算回收率。
取少量干燥样品压片（313室），交给测试室教师测试红外图谱。
解析IR图谱，归属主要官能团的特征峰；解析4-羟基香豆素的1H-NMR图谱（附录2）中所有吸收峰。
2.华法林的制备和柱层析分离
在反应瓶中加入81 mg（0.5 mmol）4-羟基香豆素（可直接使用纯品）、146 mg （1 mmol）亚苄基丙酮和15 mg（催化量）苄基三乙基氯化铵（TEBA），再加入10 mL水，磁力搅拌下回流反应2小时。
停止加热，冷却至室温，将反应液倒入10 mL 饱和食盐水中，乙醚萃取两次，每次15 mL；合并有机相并用无水硫酸钠干燥30 分钟以上。
以正己烷与乙酸乙酯的混合液为展开剂（体积比在1:1~5:1之间），用TLC （薄层层析）法分析上述有机相，在报告纸上以1:1的比例画出观察到的TLC 现象，标出各点所代表的化合物，分别计算R f值。
将TLC板标上选手编号，交给监考老师。
过滤干燥后的有机相，室温水浴下旋转蒸发除去乙醚得产物粗品，粗品用二氯甲烷溶解后加入适量100~200目硅胶，旋转蒸发得硅胶吸附物。
参照附录1，用300-400目的硅胶干法装柱（约11~12 g硅胶，请用烧杯称取），快速柱层析纯化产物，洗脱剂为正己烷与乙酸乙酯混合液（请选择洗脱剂的混合比例，然后向监考老师索要极性与之最为接近的洗脱剂）。
用试管接收洗脱液，收集产物，通过TLC与华法林样品溶液进行比对，在报告纸上以1:1比例画出观察到的TLC现象。
将TLC板标上选手编号，交给监考老师。
旋转蒸发（不计入实验时间），得纯净产物华法林，将装有产物的烧瓶标记选手编号，用真空泵抽去残余溶剂，称重，计算产率。
将装有产物的烧瓶交给监考老师，用于HPLC测试产物纯度（赛后由老师测试）。
七．产物谱图解析和思考题
产物的IR、1H-NMR谱图见附录3、4。
产物的HPLC图谱显示为纯净化合物，但其1H-NMR（d-CDCl3）显示出两套吸收峰。
1）请推测这两套峰分别代表的结构（不必归属）。
2）请推测两种结构的比例约为多少？并说明理由。
快速柱层析简介
Flash Chromatography
快速柱层析是一种广泛应用的快速、有效分离有机化合物的方法，与传统柱层析相比，快速柱层析所用硅胶粒度更细（如：300~400目），用量较少，装填高度一般约为柱直径的1.5~4倍。
快速柱层析通过加压方式提高洗脱速度，达到快速分离效果。
选择合适的洗脱液对于快速柱层析的分离效果至关重要，可用TLC法辅助选择合适极性的洗脱液，洗脱液的极性可通过两种或多种不同极性的溶剂以适当的比例混合来调节，一般以能使主产物TLC的R f值在0.3左右的为宜。
装柱可采用湿法或干法两种，其中干法装柱由于操作较为方便、快速被更广泛的应用。
以下是干法装柱及快速柱层析具体操作步骤：
干法装柱：取合适层析柱，通过漏斗缓慢加入适量300~400目的硅胶，轻轻敲击层析柱上端（也可以在橡胶垫上轻轻地弹击硅胶柱），使硅胶面平整。
在层析柱下端连接水泵，减压使柱中硅胶抽紧，关闭活塞，在硅胶柱上表面均匀地平铺一层石英砂。
自层析柱上端沿壁缓慢加入低极性溶剂，尽量不要冲动石英砂。
打开活塞，水泵减压，当有液体流出时，关闭活塞，断开水泵。
连接加压球，用橡皮筋固定，打开活塞，加压将柱中剩余溶剂压出，当溶剂液面接近硅胶面上沿（略高出1~2mm）时，停止加压，关闭活塞，打开加压球边上放气旋钮，解除柱中压力，完成装柱。
上样和分离：将粗产物的硅胶吸附物自漏斗加入层析柱，轻轻敲击使其表面平整，加一层石英砂（厚度约为2 mm）。
装上溶剂球（储液球），用橡皮筋固定，小心沿壁加入适量洗脱液，加压层析，用干净试管接收流出液，通过调节压力将洗脱液流出速度控制在连续流动状态。
若需补加洗脱液，应先解除柱中压力，再重复上述操作。
通过TLC识别含有产物的流出液，合并并旋转蒸发除去溶剂，浓缩得产物。
注意事项：装柱和洗脱过程中不能使硅胶干裂，以免影响分离效果。
4-羟基香豆素的1H-NMR图谱（500MHz, d6-DMSO）
华法林的红外图谱（KBr压片）
华法林的1H-NMR图谱（500MHz, d-CDCl3）。
