纳豆激酶分离纯化研究进展

纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究

纳豆是日本的传统大豆发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵而成，在日本已食用近千年。1987年，须见洋行等经过对上百种食物的筛选，首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。研究表明，NK是纳豆发酵过程中纳豆芽孢杆菌分泌的一种丝氨酸蛋白酶[1]。进一步的研究表明，NKc具有很强的体内外溶栓作用，与传统的容栓剂相比，NKc具有易提取、成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而可能成为新一代的溶栓药物[2-4]。为了对NKc的开发提供理论依据，本实验室在研究NKc纤溶活性之后，进一步对其体外溶栓和溶血作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：为本实验室自日本纳豆分离纯化菌种，保存于养琼脂斜面，营养琼脂配方为：细菌培养用胰蛋白胨(bacto-tryptone)，1%；细菌培养用酵母抽提物(bacto-yeast extract)，0.5%；NaCl,0.5%；细菌培养用琼脂粉(bacto-agar powder)，1.5%PH7.2。

纳豆、纳豆提取液：按文献[5]介绍方法制备。

血平板：用生理盐水配制1%琼脂，加入新鲜脱纤兔血，混匀倾注平板，冷却凝固即成。 主要试剂：凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶（中国药品生物制品检定所）；蚓激酶(30×104 U•粒-1，北京百奥药业有限责任公司)；牛血清白蛋白(上海生化试剂公司)；低相对分子质量标准蛋白质(兔磷酸化酶：Mr97.4×103,牛血清白蛋白：Mr66.2×103,兔肌动蛋白：Mr43.0×103,牛碳酸酐酶：Mr31.0×103,胰蛋白酶抑制剂：Mr20.1×103,鸡蛋清溶菌酶：Mr14.4×103)（上海生化试剂公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 NKc分离纯化 纳豆提取液经35%～75%饱和度硫酸铵分段盐析，离心收集沉淀，用50mmol•L-1磷酸缓冲液（PH 7.4）溶解，充分透析后获得纳豆激酶粗酶（NKc），再经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱（1.0cm×60cm）层析，分管收集纤溶活性较高部分，脱盐，冷冻干燥后获得层析纯纳豆激酶（NKc），SDS-PAGE电泳检测纯度。

氨基酸和生物资源２００７，２９（２）：４９～５１　Ａｍ／ｎｏ　Ａｃｉｄｓ＆Ｂｉｏｔｉｃ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　

一种食源性溶栓酶的分离纯化与部分酶学性质的研究　

鲍艳霞　，　陈钧　，王萍　，钱之玉　，　倪孟祥　

（１．中国药科大学高职学院，江苏镇江２１２００３；２．江苏大学生命与环境工程学院，江苏镇江２１２０１３；　

３．中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京２１０００９）　

摘要：目的对以豆渣为原料，接种纳豆菌的发酵物分离纯化和酶学性质研究。方法采用生理盐水浸提、（ＮＨ　）：ＳＯ　分级　沉淀、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一１００凝胶层析等纯化步骤，得到层析纯的食源性溶栓酶一纳豆激酶，结果经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为二　个组分。酶学性质研究表明，以酪蛋白为底物时，最适反应温度为６０℃，最适反应ｐＨ为８．０，在ｐＨ７～９溶液中，３７℃以下基　本稳定。体外溶栓作用表明，纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式主要是直接溶解，而不是纤溶酶原激活剂。　关键词：食源性溶栓酶；分离纯化；性质　中图分类号：Ｑ８１４．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６—８３７６（２００７）０２—００４９—０３　

血栓是引起心肌梗死、脑卒中等心脑血管疾病　死亡的重要因素，抑制血栓形成和增强纤溶活性对　

心脑血管疾病防治具有重要意义。传统的尿激酶和　

链激酶等虽有快速溶解血栓的优点，但有半衰期短、　易出血等不足ｕ　Ｊ。因此从膳食成分中发现和开发　

抗栓和溶栓物质，具有广泛的临床实用价值。　

１９８７年，须见洋行等从日本传统发酵大豆食品　

一纳豆中发现溶解纤维蛋白的活性成分，并命名为　纳豆激酶（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，ＮＫ）　Ｊ。ＮＫ是发酵过程中　

由纳豆菌分泌产生的丝氨酸蛋白酶∞Ｊ。药理学研　

究结果表明，纳豆激酶具有很强的体内外溶栓作用，　

并具口服吸收溶栓的优点，是一具有开发潜力的食　源性溶栓药物，目前正引起医药及食品研究领域的　广泛关注Ｍ　Ｊ。作者在获得产纤溶酶的纳豆菌株基　

＝＝６８　２０１１年１２月　第３２卷第１２期　食品研究与开发　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　基础研究　

纳豆中ＳＯＤ的分离纯化及性质的研究　

崔明勋，姜成哲，李太元　

（延边大学农学院，吉林延吉１３３０００）　

摘要：通过采用不同的溶液、ｐＨ：＇Ｔ＊，￣－ｇ－度处理探讨了对ｓＯＤ提取物活性的影响，采用硫酸铵沉淀法粗提，葡聚糖凝胶　过柱，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法判定纯度。结果表明，提取时纳豆捣碎与否结果没有差异，采用缓冲液效果较好。采　用５０℃以上的温度处理影响酶活性，硫酸铵饱和度在６５％～９０％时得到较纯的酶粗提物，ｐＨ５．９的条件下有利于分离　纯化，得到了分子量为３．８６ｘｌ０４ｕ的Ｆｅ—ＳＯＤ型ＳＯＤ。　关键词：纳豆；超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）；ｐＨ；温度　

Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｎａｔｔｏ　

ＣＵＩ　Ｍｉｎｇ－ｘｕｎ，ＪＩＡＮＧ　Ｃｈｅｎｇ－ｚｈｅ，ＬＩ　Ｔａｉ—ｙｕａｎ　

（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙａｎｂｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｊｉ　１３３０００，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ｐＨ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ，ｔｅｓｔｅｄ　ｔｈｅ　ＳＯＤ　

ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｒｕｄｅ　ＳＯＤ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ａｍｍｏｎｉｕｍ—ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ｇｅｌ，ｔｈｅ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｔｏ　ｄｅｃｉｄｅｄ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｒｅｓｕｌｔ　ｐｕｒｉｔｙ　ｔｈａｔ　ｗｉｔｈ　ｏｒ　ｗｉｔｈｏｕｔ　

广东饲料第２２卷第９期２０１３年９月

纳豆及纳豆激酶的研究进展

王丽荣陈雷林显华谷巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安２７１０００）【中Ｉ㈣］Ｓ８１６．７

【文献标识码】Ａ【文章编号】１００５—８６１３（２叭３）０９—００２７－０３

【摘要】纳豆具有丰富的营养价值，并富含维生素Ｋ！等，可提高蛋白质的消化吸收率，在发酵过程中，可以产生纳豆激酶，降解纤维蛋白原，并可以将纤维酶原激活为纤溶酶，从而刺激产生纤溶酶原激活剂。纳豆激酶以安全、高效、稳定，且成本较低、易吸收、副作用小、作用时间长等优点，成为较为理想的保健及溶栓药物之一。本文对纳豆及纳豆激酶做了综述性研究，为更好的研究开发纳豆及纳豆激酶产品奠定基础。［关键词】纳豆；纳豆激酶；作用；展望

纳豆起源于中国，又被称为“酱豆”，是一种传

统的发酵食品，后传人日本，根据日本的风土发展

了纳豆。纳豆是由黄豆经过纳豆菌发酵而成。研究得知，大豆内的蛋白质成分具有不溶解性，而做成

纳豆后，具有黏性，营养价值高，含有大量的维生

素Ｋ，，并且可以帮助胃肠道消化吸收。纳豆的主要

成分为：水分６１．８％、粗蛋白１９．２６％、粗脂肪８．１７％、碳水化合物６．０９％、粗纤维２．２％、灰分

１．８６％，作为一种植物性食品，纳豆的粗蛋白与脂肪非常丰富，具有很好的保健功能。纳豆发酵产生

的纳豆激酶，是直接分解血栓的纤维蛋白酶，１９８７

年日本的ＳｕｍｉＨ等人首次发现纳豆含有溶解血

栓纤维蛋白的成分，是一种由纳豆菌或纳豆枯草

杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，并将其命名为纳

豆激酶（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，ＮＫ）。纳豆激酶具有很强的溶

栓作用，甚至要超过尿激酶，而且不会经过胃部分解失活。很多学者对纳豆激酶进行了分子结构、药

理学及药效、临床试验等方面的研究，发现纳豆被食用后，血液中血栓的形成机会减少，而溶解血栓

的物质反而增加，从而达到一种动态平衡。

近年来研究发现，中老年人发生心肌梗死及

脑卒中等心脑血管疾病的发病率有上升的趋势，