发酵法生产纳豆激酶的研究进展

2019年第6期

摘要：纳豆激酶

是一种从纳豆中提取的蛋白酶，具有显著的体内外溶栓活性，有望开发成为新一代溶栓药物。目前，纳豆激酶主要通过微生物发酵制得，但发酵产率不高阻碍了其进一步开发。主要从菌种选育和发酵工艺这2个生产关键环节进行综述，为其进一步开发提供了参考。关键词：纳豆激酶；发酵；菌种选育；工艺优化；研究进展中图分类号：Q815文献标志码：Adoi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2019.06.062

（1.SchoolofMedicineandChemicalEngineering，YanglingVocational&TechnicalCollege，Yangling，Shaanxi712100，China；2.ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing，Jiangsu211198，China）Nattokinaseisaproteaseextractedfromnattowithsignificantinvitroandinvivothrombolyticactivityandisexpect-edtobedevelopedintoanewgenerationofthrombolyticdrugs.Atpresent，nattokinaseismainlyproducedbymicrobialfer-mentation，butthelowyieldoffermentationhindersitsfurtherdevelopment.Thispapermainlysummarizedthetwokeypro-ductionstepsofstrainselectionandfermentationprocess，andprovidedreferenceforitsfurtherdevelopment.nattokinase；fermentation；strainselection；processoptimization；researchprogress

纳豆激酶（Nattokinase，NK）最初是由日本心

脑血管专家须见洋行教授从纳豆发酵过程中提取得

到的一种碱性丝氨酸蛋白酶[1]。研究表明，纳豆激酶

溶血栓能力强，可通过直接和间接双重作用来持续

发挥其纤溶活性[2-3]。通过体外溶栓试验发现纳豆激

酶可以很好地溶解纤维蛋白凝块[4]，体内大鼠静脉注射纳豆激酶试验表明纳豆激酶纤溶活性是血纤维蛋

白溶酶的4倍以上[5]。也有研究表明，健康人口服纳

豆激酶可以缩短优球蛋白溶解时间[6]。目前，纳豆激

酶主要通过微生物发酵法生产，主要对发酵法生产

纳豆激酶过程中菌种选育和发酵工艺2个方面进行

总结，以期为纳豆激酶生产提供参考。

1菌种选育

作为微生物工业化发酵三大技术领域之一的菌

种选育，在微生物药物的发酵生产中有着至关重要

的地位。当前，发酵工业中使用的生产菌株，大部

分都是通过不同的育种技术而得到的具有高产目的

产物的菌株。

使用传统的物理诱变剂和化学诱变剂处理均匀分散的菌悬液，通过物理辐射和化学试剂能与DNA

相互作用的特点实现对菌种遗传物质的改变，进而

筛选出少数优良性状的突变株。

1.1.1紫外诱变

紫外线是使用最广泛的物理诱变剂，当它照射

微生物细胞时，会导致微生物DNA分子形成嘧啶二

聚体，进而可能引起菌株突变或死亡。薛健等人[7]利

用20W紫外灯照射纳豆激酶生产菌90s，获得了

1株产纳豆激酶酶活达498.84IU/mL菌株，比原始菌

株提高了6.78%。王雅君等人[8]使菌悬液在距离紫外

灯28~30cm的位置，最佳照射时间为60s时，经过

初筛和复筛得到正突变纳豆芽孢杆菌U49，其产纳豆

激酶酶活为1329.62IU/mL，比出发菌株Z1提高了

100.34%。余功保等人[9]采用紫外诱变成功筛选出了

BSN-3菌株，该菌株的酶活比原始菌株酶活提高了

258%。

1.1.2亚硝基胍诱变

具有超诱变剂之称的亚硝基胍（NTG）是一种烷

化剂，在处理放线菌、细菌等微生物时，能使它们

的细胞发生连续突变，不经淘汰就可以直接得到10%

以上的营养缺陷型突变株。沙维[10]采用0.3mg/mL亚硝发酵法生产纳豆激酶的研究进展

文雯1，2，周博1，胡莉娟1

（1.杨凌职业技术学院药物与化工分院，陕西杨凌712100；2.中国药科大学，江苏南京211198）

收稿日期：2019-01-28作者简介：文雯（1991—），女，硕士，助教，研究方向为药学方面的教学与研究。文章编号：1671-9646（2019）06b-0081-03第6期（总第482期）农产品加工No.62019年6月FarmProductsProcessingJun.农产品加工2019年第6期

基胍对T-3纳豆杆菌处理20min，诱变2轮，筛选

得到突变株Y2-1菌株，其产纳豆激酶活力比原始菌

株提高14.8%，达到5740IU/mL。

1.1.3硫酸二乙酯诱变

硫酸二乙酯（DES）也属于烷化剂的一种，是一

种常见的化学诱变剂。许建平等人[11]对枯草杆菌

B826进行硫酸二乙酯处理，并筛选得到高效稳定的

突变株。

近年来，在诱变育种方面除了经常使用的传统

的诱变剂以外，还开发出一些新型的诱变剂，比如

微波、超声波、激光、离子注入和高能电子流等，

它们在诱变育种中取得了较好的效果。下面介绍几

种纳豆激酶生产菌株使用过的新型诱变剂。

1.2.1微波诱变

微波是近年来发展较快的新型物理诱变剂，研

究表明一定频率的微波会干扰细胞内DNA分子氢键

和碱基堆积力，进而对微生物产生一定的致死能力

和诱变效应[12]。沙维[10]用380W微波在加热累计时间

40s的条件下，经过2轮诱变筛选得到突变株

W2-1，其发酵得到的纳豆激酶酶活为5450IU/mL，

比原始株提高9%。王雅君等人[8]对纳豆芽孢杆菌Z1

采用微波诱变，经过筛选得到突变株W51，其相对

纳豆激酶活力为735.19IU/mL。

1.2.2离子注入诱变

离子注入是20世纪80年代初兴起的一种处理

材料表面的高新技术，所谓离子注入诱变，就是利

用低能离子注入生物体引起遗传物质改变，造成性

状变异，达到育种目的方法[13-14]。这种诱变方法具有

方向性和可控性，高宏[15]将30×2.6×1013~200×

2.6×1013ion/cm2N+注入枯草芽孢杆菌，最终得到

稳定遗传突变株，酶活比原始菌株提高了160%。

1.2.3超声波诱变

超声波会导致微生物菌体细胞内的空化作用，其产生的高温和高压在一定条件下可以使细胞具有

突变的可能性。目前，利用超声波诱变育种已有很

多报道，超声的功率、频率和时间是超声波诱变的

关键因素。沙维[10]用70kHz，220W超声波对原始

菌株累积处理25min，筛选获得突变株C2-1菌株，

其发酵生产的纳豆激酶活力达到5585.35IU/mL，比

原始菌株提高了11.7%。

1.2.460Co-酌射线诱变

60Co-酌射线是高能电磁波的一种，其可以产生较

强的电离辐射，该辐射可作用于微生物细胞的遗传

物质，发生染色体断裂，从而引发基因结构变化，

致使微生物的突变。李淑英等人[16]用800Gy的

60Co-酌射线诱导纳豆激酶生产菌，一共得到60株活

性增加的菌株。古亚楠[17]用500Gy60Co-酌射线诱变纳豆菌菌株，正向突变率3.4%，并筛选得到1株酶

活为2040.54IU/g的菌株。

复合诱变也称联合诱变，一般指先后使用2种

或2种以上的诱变剂或者多种诱变剂同时使用。如

果诱变剂合理搭配使用，则一般效果优于单一的诱

变，会产生协同效应。关志炜[18]通过物理诱变剂紫

外线和化学诱变剂盐酸羟胺进行复合诱变处理，采

用利福平抗性平板和发酵相结合的筛选方法，获得

了突变株NU9012，其产酶能力提高了68%，达到

648IU/mL。蔡超靖等人[19]采用光敏试剂8-甲氧基

补骨脂素和紫外诱变相结合，对根酶Rh23原生质体

进行复合诱变，得到了高产且发酵性能稳定的突变

株。桂丽等人[20]采用微波和紫外线复合诱变，最终筛

选得到产纳豆激酶活力为2200IU/g的突变株。

原生质体对诱变剂的敏感性高于孢子或菌体细

胞，将原生质体再生与原生质体诱变相结合，已经

成为微生物育种的重要手段。刘新梅等人[21]对纳豆菌

B.N.K菌株的原生质体再生育种，试验结果表明，直

接再生发生了正突变，提高了纳豆激酶酶活力，并

且发现原生质体直接再生菌株虽可产生变异，但变

异幅度较原生质体经紫外诱变要小。试验采用原生

质体技术和紫外诱变联合技术最终获得产纳豆激酶

酶活较高的菌株UV103，UV212。

虽然工业生产中使用的高产菌株大多是通过物

理或化学手段进行诱变育种得到的，但是随着时代

的进步，传统诱变方法的诱变盲目性、筛选工作量

大、遗传不稳定等缺点越来越凸显。越来越多的人

利用基因工程育种技术对原始菌株进行有目的、定

向的改造，并取得了显著的成效。WeiX等人[22]利用

PCR基因扩增技术筛选出1株纳豆激酶高产菌株。

赵菡等人[23]通过对远离酶活性中心的Asn和Gln位点

进行突变体构建，最后筛选得到突变体Q59E，催化

活性显著提高。YongjunC等人[24]利用DNAshuffling

技术筛选得到纳豆菌产纳豆激酶活力提高了2.3倍。

YouL等人[25]采用连续循环易错PCR技术在枯草杆菌

蛋白酶E中引入随机突变并筛选突变文库，获得活

力提高的突变体。

2发酵工艺的优化

为了提高纳豆激酶的活力，除了菌种选育以外，

还需要对发酵过程中各种参数条件进行试验设计考查。

液体发酵主要指借助于液体介质来完成的发酵。

此种发酵方式成本低廉、菌体生长快速、发酵周期

短、可以进行大规模生产。目前，我国许多科研院82窑窑