2--2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(已用)幻灯片课件

提示：土壤中分解尿素的细菌能 合成脲酶，只有能合成脲酶的微 生物才能有能够利用尿素 的微生物才能够 生长。
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种 类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类
微生物生长的培养基。
如何证明这种培养基有选择作用呢？
设置对照组：制备牛肉膏蛋白胨培养基进行相同 样品的微生物培养，比较两种培养基菌落的数目
微生物的培养与应用
一、基础知识 （一）筛选菌株
1、实例：耐高温的Taq DNA聚合酶的筛选
70-80℃高温环境中
2、筛选菌株原理：人为提供有利于目的
菌株生长的条件（营养、温度、PH），同时 抑制或阻止其他微生物生长。
1、碳源和氮源分 别是什么物质？ 碳源-葡萄糖
氮源-尿素
2、该培养基是否具 有选择作用？
另一种方案： 将A同学配制的培养基在不加土样的情况 下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是 否受到污染。
2.制备培养基 ：
牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基
牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培 养基是否起到了选择作用。
3.微生物的培养与观察
梯度稀释 涂布平板
将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理 盐水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大 试管中，依次等比稀释至107稀释度，将 103 ～ 107倍的稀释液分别吸取0.1 mL涂布 到平板上培养。每个稀释度下涂布3个选择培养
目的：为了增强实验的说服力和准确性
（ 重复组 ）
每克样品中的菌株数
C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml) M：稀释倍数
例：某土壤样品稀释106倍，取0.1ml稀释液涂布平 板，得到50个菌落，则每克样品中的菌株数为？

但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没有设计 对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学排除上 述两个可能影响因素吗？
方案1：其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学 一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培 养基的配制有问题。
㈢设置对照
1.目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果 的可信度。
2.实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学 从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在 同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学结果有问 题，可能是A同学培养基被杂菌污染，或者培养基混入其他含氮物质， 导致其他杂菌生长。
3.选择培养基
本课题使用的培养基
KH2PO4
1.4g
NaHPO4
2.1g
问题1：该培养基的配方中，为微生物的生 长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
MgSO4 .7H2O 0.2g
葡萄糖
10.0g
尿素
1.0g
问题2：此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？ 为什么？
能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作 为氮源而生存。
计算公式： 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所 用的稀释液的体积(mＬ)，M代表稀释倍数。
【例2】：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细 菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落 数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值 163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题， 错在哪？

培养基的种类情况
培养基
稀释倍数
103
104
105
106
平板1
242
210
202
102
选
择
平板2
250
240
86
98
培
养
平板3
310
250
198
120
基
平均数
162
106
牛肉膏蛋白胨 平板4
培养基
（对照）
菌落计数方法
例 不同浓度的平均菌落数
次 101
102
103
1 1365 164
20
2 2760 296
例：46（103）和296 （102）均在30～300之间，
则：46×103÷296×102≈1.6，
应取二者的平均值。
46×103÷296×102
(
0.1(ml)
) ÷2=3.775×105
3. 若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释 度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例4)。
培养基配方三
1.4g 0.2g
Na2HPO4 葡萄糖
1.0g
琼脂
2.1g 10.0g 15.0g
（一）筛选菌株——尿素细菌的分离
1.原理：根据某种微生物的特殊营养要求或其对物理、化 学因素（营养、温度、pH等）的抗性而设计的。
2.功能：使混合菌群中的目的菌株变为优势菌，从而提高 该菌的筛选效果。
3.方法：利用选择培养基来实现。
105
106
107
101
10g土壤
9ml
无菌水
9ml 无菌水
104
105
106

(B )
B. 2.34×109
C. 234
D. 23.4
每克样品中的菌株数 =（C÷V）×M
看课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如 果有问题，错在哪？
第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板） 第二位同学：A组结果误差过大，不应用于计算平均值
说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定 要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实 验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定 要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不 一致，意味着操作有误，需要重新实验。
Taq细菌
寻找
寻找
耐高温的酶
耐高温生物体
耐高温环境（热泉、火山口）
启示：寻找目的菌种时要根据它对_生__存__环__境__的__要__求__，到 相应的环境中去寻找。(自然界菌株筛选的原理)
筛选原因: 因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物， 使耐热的Taq细菌保留下来。
2 实验室中微生物的筛选原理
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进 行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少
设置对照的目的：
主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响， 提高实验结果的可信度。
①判断培养基中是否有杂菌污染：
将未接种的培养基同时进行培养。
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3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒 状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 4.课题目的
1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
一、研究思路
(一)筛选菌种
1 实例：寻找耐高温的DNA