绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究

绿色荧光蛋白GFP的研究与应用摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一种极具潜力的标记物，有着广泛的应用前景。

通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献，对GFP有了进一步了解。

关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；性质；原理；应用1 引言发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。

1962 年,Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequoria victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮, 浅绿色荧光”的副产物。

1974 年,Shimomura等纯化得到了这种自发荧光的蛋白（即GFP）。

2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·查尔非(Mratin Chalfie)以及美国华裔科学家钱永健(Rorge Y.Tsien)，他们三人因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出了突出成就。

2 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。

GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。

GFP性质极其稳定，耐高温，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。

其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。

更重要的是，它们在pH7.0~pH12.2的范围内的吸收、发射光谱也是相同的。

绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）是一种从水母Aequorea victoria中分离出来的荧光蛋白质，可以发射绿色荧光。

由于GFP具有结构简单，对细胞无毒性和较强稳定性等特点，因此被广泛应用于细胞生物学和生命科学研究中。

以下是关于GFP及其在细胞生物学研究中的应用的介绍。

一、荧光蛋白及GFP的来源荧光蛋白质是一种含有环状芳香族氨基酸残基的蛋白质，能够吸收外部能量并将其转化为荧光发射。

GFP最初是在1955年，美国南加州大学的Osamu Shimomura研究水母发光机制时发现的。

GFP由238个氨基酸组成，分子量约27kDa。

GFP基因被克隆后即可在其他生物中表达，使它成为了生物体内最常用的荧光标记物之一。

二、GFP的结构和原理GFP的荧光由3个氨基酸残基Tyr（酪氨酸）、Ser（丝氨酸）和Gly（甘氨酸）构成的环状结构决定。

当氧气与Tyr形成共轭键时，便使荧光激发能量被吸收，并在GFP分子腔内缓慢扩散，直至荧光发射。

三、GFP在细胞生物学中的应用1、荧光定位GFP被广泛用于生命科学中细胞定位的研究。

由于GFP具有细胞膜透性和结构稳定性等特性，可以将其组装到生物体内，使其具有明亮的绿色荧光。

通过转化所需的基因序列来表达GFP，可以使研究人员直接在活细胞中观察到融合GFP蛋白质的定位和空间分布状况。

2、蛋白质交互作用GFP也被用作蛋白质交互作用的研究工具。

在这种情况下，GFP被连接到研究的蛋白质上，而研究人员观察到GFP与其他蛋白质结合的情况，从而确定蛋白质之间是否相互作用。

3、表达和异常行为GFP还可用于研究蛋白质的表达和异常行为。

通过表达GFP基因，可以探究研究对象的分泌情况、活动状态、质量控制和分解情况等。

4、细胞轨迹追踪GFP被广泛应用于细胞追踪研究中。

通过转染GFP基因，可以实时跟踪特定细胞类型的运动和位置，比如细胞分裂、游走和迁移等。

绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用绿色荧光蛋白(GFP)是生物学中非常著名的一个标记蛋白，它可以帮助科学家们观察、追踪细胞内部分子的运动和位置变化。

本文将介绍GFP的结构、功能以及在细胞生物学中的应用。

GFP结构与功能GFP来自于海葵(海洋无脊椎动物)中的一种发光蛋白，它的结构中含有一个环状结构(环状柄)和一个β桶(β-barrel)。

环状柄中含有一个色素分子，称为染料环，贡献了GFP的光学特性。

β桶的作用是保护染料环，并使它的光学特性达到最佳状态。

GFP有着非常特殊的性质，它可以在自然光下发出荧光，荧光颜色为绿色。

当其暴露在213-488nm的紫外线照射下，GFP就会发射从蓝、绿到黄的荧光波长。

GFP的这种特性使得它成为了生物学家们进行光学研究的最佳工具。

1. 显微镜下的成像GFP是一种非常强的标记蛋白，通过将其融合到目标物分子上，可以非常清晰地显示该分子的位置和运动。

利用显微镜技术，研究人员可以观察到细胞器、蛋白质、RNA等生命大分子在细胞内的运动和相互作用，从而揭示其在生物学中的重要作用。

2. 基因表达与细胞注释通过将GFP基因转染到细胞中，可以实现在特定细胞和组织中进行特定基因的表达。

同时，在转染GFP的细胞中，人们也可以通过显微镜监测到特定细胞的位置和分布，用于细胞的标记与识别。

3. 胚胎发育研究GFP还可以用于观察和研究胚胎发育过程中各种细胞分子的运动和定位。

通过将GFP融合到发育过程中的标志性分子中，研究人员可以观察到该分子在胚胎发育的不同阶段中的表达和变化，从而揭示胚胎发育的机制。

总结GFP的发现和应用开创了一种全新的标记技术，使科学家们能够更深入地探究生命大分子的运动、位置和相互作用。

GFP的强烈荧光使得其在细胞生物学研究中具有广泛的应用价值，特别是在显微镜下的成像、基因表达与细胞注释以及胚胎发育研究中。

可以预见，在不久的将来，GFP的应用将会更加广泛，并将继续推动生命科学研究的进步。

gfp的应用原理步骤1. 简介GFP（Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白）是一种来自于蓝绿色发光苔藓（Aequorea victoria）的一种蛋白质，它能发出绿色荧光。

GFP在生物领域具有广泛的应用，特别是作为荧光标记的工具，用来研究细胞生物学和生物化学等方面的问题。

本文将介绍GFP的应用原理步骤。

2. GFP的应用原理GFP的应用主要基于其特殊的结构和发光机制。

GFP的分子结构中包含一个环状的花青质染色体，通过紫外线或蓝光激发后，花青质染色体接受能量并发出绿色荧光。

GFP的应用原理步骤可以大致归纳为以下几个方面：2.1. GFP的基因表达与转染要应用GFP进行生物学研究，首先需要将GFP的基因导入到待研究的目标细胞中。

通常使用基因转染技术，将GFP基因导入细胞质或细胞核中，并使其被目标细胞所表达。

2.2. GFP的定位与追踪一旦GFP基因在目标细胞内表达成功，GFP蛋白质将被合成并定位在细胞的特定位置。

通过显微镜观察，可以实时追踪GFP蛋白的定位，揭示细胞器、细胞结构以及其他目标的位置和形态。

2.3. GFP的功能分析GFP的应用不仅仅局限于细胞定位的研究，还可以用于功能分析。

通过将GFP 蛋白与其他感兴趣的蛋白质进行融合，可以观察到蛋白质在细胞内的表达和功能活性，从而研究蛋白质的功能和相互作用。

2.4. GFP的动力学分析还可以利用GFP技术进行动力学研究，通过观察GFP蛋白在细胞内的动态变化，如运动轨迹、生长速度、参与细胞分裂等，揭示细胞的生物学过程和机制。

3. GFP的应用步骤应用GFP进行细胞生物学和生物化学研究的步骤如下：步骤1：选择适当的表达载体选择合适的表达载体，将GFP基因插入其中，并与目标蛋白的编码序列进行融合，以实现目标蛋白的表达和GFP的定位。

步骤2：转染目标细胞采用合适的转染技术将表达载体导入目标细胞，并使用适当的筛选标记（如抗生素抗性基因）筛选成功转染的细胞。

绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种具有绿色荧光的蛋白质，广泛应用于生物学领域的标记和成像技术中。

绿色荧光蛋白的研究和应用已经成为生命科学领域中的热点和前沿课题。

在这篇文章中，我们将深入探讨绿色荧光蛋白的种类、结构、功能和应用。

1. 绿色荧光蛋白的种类绿色荧光蛋白是由Aequorea victoria（水母）发光器官中分离出来的一种蛋白质。

根据不同的来源和结构特点，绿色荧光蛋白可以分为多种类别，包括标准GFP、改良GFP、超变荧光蛋白和环状GFP等。

每种类型的绿色荧光蛋白都具有不同的荧光特性和适用范围。

2. 绿色荧光蛋白的结构绿色荧光蛋白的结构是其功能的基础。

它是一个由238个氨基酸组成的蛋白质，包括一个β桶结构和一个共轭双键序列。

在特定的条件下，它可以通过自发性氧化反应形成荧光色团，并发出绿色的荧光。

绿色荧光蛋白的结构和光学特性为其在生物标记和成像领域的应用奠定了基础。

3. 绿色荧光蛋白的功能作为一种生物标记物，绿色荧光蛋白的主要功能是在转基因生物中标记特定的细胞、器官或组织，以便于研究者对其进行观察和分析。

通过转基因技术，研究人员可以将绿色荧光蛋白基因导入到目标生物体中，从而实现对其活体成像和实时监测。

绿色荧光蛋白在蛋白质定位、蛋白质-蛋白质相互作用和基因表达调控等方面也发挥着重要作用。

4. 绿色荧光蛋白的应用绿色荧光蛋白的广泛应用领域包括但不限于以下几个方面：a. 细胞成像与实时监测：通过转基因技术将绿色荧光蛋白标记到感兴趣的细胞中，可以实现对其活体成像和实时监测，从而揭示生物体内细胞的运动、分化和凋亡等过程。

b. 蛋白质定位与跟踪：通过融合绿色荧光蛋白与感兴趣蛋白质，可以实现对蛋白质在生物体内的定位与跟踪，从而研究其功能和代谢途径。

c. 蛋白质-蛋白质相互作用研究：利用双融合蛋白技术或FRET技术，可以实现对蛋白质-蛋白质相互作用的实时观察和分析，为研究蛋白质分子机制提供了有力工具。

发光细菌GFP的表达机理及应用发光细菌GFP是绿色荧光蛋白的简称，是由Aequorea victoria这种水母所产生的一种蛋白质。

GFP不但具有高度的应用价值，而且还是生物学研究中最有用的分子标记之一。

本文将从发光细菌GFP的表达机理、应用以及未来发展等方面进行介绍。

一、发光细菌GFP的表达机理GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白质，主要在海水深处生活的Aequorea victoria珊瑚中产生。

GFP通过吸收紫外线光激发，产生荧光。

GFP能在任何类型的生物组织内发光，不会产生有害影响。

除了绿色之外，GFP还能产生黄色、蓝色、紫色、红色等颜色的荧光。

这些颜色的荧光由不同种类的GFP进行表达，这些不同种类的GFP都具有不同的结构和光学特性。

GFP的结构包含一个由11肽段组成的β桶状结构和一个由α螺旋段组成的关键性结构域。

通过对这个结构域的分子工程改造，研究人员可以对GFP进行改造，使其在其他物种内表达并发光。

二、发光细菌GFP的应用GFP已成为生物医学领域的热门研究课题。

由于GFP可以与其他蛋白质相结合，并且不会对细胞造成任何影响，能够用于实现对生物系统的准确研究。

GFP可以制作成质粒，通过质粒转染等方法，将其导入到需要研究的细胞内。

利用GFP可准确观察到细胞内各种蛋白质分子的定位和表达等情况。

1、生物病理学：GFP在生物病理学领域已经有了广泛的应用。

与其他标记方法相比，GFP标记具有许多优势。

第一，当有多种标记时，GFP在背景噪音中更易于辨认；第二，直接观察细胞在活体状态下的各种功能，例如细胞的表面形态、细胞器的运动等。

2、分子生物学：GFP已经成为分子生物学中最重要的分子标记技术之一。

通过观察GFP标记蛋白分子的表达、定位和交互关系，有助于更好地理解生物化学反应。

利用GFP标记，研究人员可以更好地分离和分析蛋白质、DNA和RNA，进一步深入研究生物化学反应。

3、神经科学：大多数神经科学家利用GFP生物标记技术，将化学物质或电压灵敏的通道与GFP合并。

GFP:绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。

它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。

发光机理:当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。

但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。

上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程,系由几位科学家分别研究完成的。

绿色荧光蛋白不仅无毒,而且不需要借助其他辅酶,自身就能发光,可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。

当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时,蛋白质既能保持其原有的活性,绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。

钱永健的贡献钱永健及其合作者,还解决了绿色荧光蛋白的晶体结构问题,从而允许能够较合理地对具不同性质的变体合成进行设计。

这些新变体有的荧光更强,有的呈黄色,有的呈蓝色,有的呈红色,有的可激活、可变色。

这意味着除绿色以外,还可以用其他颜色荧光蛋白标示不同的蛋白质和细胞。

GFP的发光特性GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder).GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察.GFP的性质GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定.GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.在生物技术中的应用1.分子标记除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。

对绿色荧光蛋白的了解及应用学院：生命科学学院姓名：马宗英年级：2011学号：2011012923前言绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。

这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。

但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。

【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用一、绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。

其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。

野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。

生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。

GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。

图2为生色团的形成机制。

图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列图2生色团的形成机制目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。

二、GFP在生命科学中的应用1、作为蛋白质标签（protein tagging）利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。

绿色荧光蛋白的研究现状与应用【摘要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。

由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。

随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。

【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。

1 绿色荧光蛋白的理论研究1.1绿色荧光蛋白的发现绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。

它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。

水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。

1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。

野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。

GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。

绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。

GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。