R547_HNMR_01743_MedChemExpress

专利名称：一种巯基氧化酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性方法
专利类型：发明专利
发明人：李茹冰,万华印,易学瑞,孔祥平,佟明华,杨联萍,柴向东,王妍
申请号：CN02134675.5
申请日：20020906
公开号：CN1472334A
公开日：
20040204
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种巯基氧化酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性方法，所采用的技术方案是以巯基氧化酶活性检测rhHSS产品的生物学活性，包括含游离巯基的底物或其制备，rhHSS氧化巯基活性的测定。

本发明提供了一种简便易行、特异敏感的rhHSS活性检测方法。

申请人：深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司
地址：518054 广东省深圳市南山区南油大道海王大厦24层
国籍：CN
代理机构：广州市拓元专利事务所
代理人：张少君
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Limited solubility
Store at +4°C
For obtaining a higher solubility , please warm the tube at 37°C and shake it in the ultrasonic bath for a while.Stock solution can be stored below -20°C for several months.
实验操作
细胞实验: 细胞系 溶解方法
反应时间 应用
来源于 6-8 周龄 Sprague-Dawley 大鼠的 DRG（背根神经节）神经 元细胞
在 DMSO 中的溶解度>10mM。为了获得更高的浓度，可以将离心 管在 37℃加热 10 分钟和/或在超声波浴中震荡一段时间。原液可 以在-20℃以下储存几个月
0.1, 1, 3, 10, 100μm 作用 2min，加入第一滴药物开始同时观察
在 DGR 神经元中，尽管 DIDS 并没有诱导 TRPV1（瞬时受体电位 香草酸亚型 1 型）自身的活化，但是显著提高了辣椒素或低 pH 诱导的 TRPV1 电流。DIDS 可以以激动剂依赖的方式改变 TRPV1 通道功能。
请测试所有化合物在室内的溶解度，实际溶解度和理论值可能略 有不同。这是由实验系统的误差引起的，属于正常现象。
参考文献: [1] Wulff, Heike. "New light on the “Old” chloride channel blocker DIDS." ACS chemical biology 3.7 (2008): 399-401. [2] Hogg, R. C., Q. Wang, and W. A. Large. "Effects of Cl channel blockers on Ca‐activated chloride and potassium currents in smooth muscle cells from rabbit portal vein." British journal of pharmacology 111.4 (1994): 1333-1341. [3] Nelson, Mark T., et al. "Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries." The Journal of Physiology 502.2 (1997): 259-264. [4] Lyons, John C., Brian D. Ross, and Chang W. Song. "Enhancement of hyperthermia effect in vivo by amiloride and DIDS." International Journal of Radiation Oncology* Biology* Physics 25.1 (1993): 95-103

中文名称5-氨基四氮唑英文名称5-Amino-1H-tetrazole hydrate ，5-Amino-1,2,3,4-tetrazole，5-Amino-1H-tetrazole，5-Aminotetrazole，5-Amino-1H-tetrazole 1-hydrate中文别名 5-氨基-1H-四氮唑四水合物;5-氨基-1H-四氮唑;CAS RN 4418-61-5EINECS号 224-581-7分子式 CH3N5分子量 85.06825-氨基四氮唑主要用途：初步调查用途用作有机合成中间体，医药中间体，5一氨基四氮唑的重氮化降解法合成IH一四氮唑，而IH一四氮唑是核酸合成的活化(催化)剂，作为磷酯化或亚磷酯化的活化剂，被广泛用于核酸合成和类似的合成反应。

初步从国外数据库中查到一些资料：P.R.ChinaInfine Chemicals Co., Limited.ProducerTCI Europe NV BelgiumGermanyNovasep Synthesis - Dynamit Nobel GmbHProducerP.R.ChinaBEYO Chemical Co., Ltd.Bulk chemical producerUSAIsland Pyrochemical IndustriesLeading producer worldwideChangzhou Weijia Chemical Co., Ltd. P.R.ChinaDKSH Schweiz AG SwitzerlandWintersun ChemicalUSASupplierP.R.ChinaJunwee Chemical Co., Ltd.Bulk chemical producerP.R.ChinaNingbo Pangs Lanza Int’L Co., Ltd.ProducerNew Dragon Industrial Co., Ltd P.R.ChinaHongda Group LimitedUSABulk chemical producer。

海洋沉积物来源哈茨木霉R5-1萜类化合物的分离鉴定与抗弧菌活性研究马新玥;赵业;梁小蕊;季乃云【摘要】从采集自渤海沉积物样品中分离得到一株海洋真菌哈茨木霉R5-1,对其扩大发酵,所得提取物采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、反相硅胶柱层析、制备薄层层析等方法分离得到5个萜类化合物wickerol B(Ⅰ)、15-hydroxy acorenone((1S,4S,5S)-8-hydroxy methyl-1-isopropyl-4-hethylspiro[4.5]dec-8-en-7-one)(Ⅱ)、cyclonerodi (Ⅲ)、epicycloneodiol oxide (Ⅳ)和cycloneodiol oxide (Ⅴ).通过核磁共振图谱及对比文献数据确定其结构,对其抗海洋来源弧菌的活性测试结果显示,5个化合物均显示出对鳗弧菌有抑制作用,其中化合物Ⅰ和Ⅴ显示出了较好的活性.【期刊名称】《烟台大学学报（自然科学与工程版）》【年(卷),期】2019(032)001【总页数】5页(P15-19)【关键词】哈茨木霉;萜类化合物;次级代谢产物;抗菌活性【作者】马新玥;赵业;梁小蕊;季乃云【作者单位】烟台大学海洋学院,山东烟台264005;中国科学院烟台海岸带研究所,山东烟台264003;烟台大学海洋学院,山东烟台264005;海军航空工程学院,山东烟台264001;中国科学院烟台海岸带研究所,山东烟台264003【正文语种】中文【中图分类】Q31木霉属真菌是自然界中分布较为广泛的真菌类群,近年来因其良好的生物防治潜力和丰富的次级代谢产物而受到广泛关注[1]．海洋生境木霉主要来源于海洋动物、植物、沉积物等,其次生代谢产物研究始于20世纪90年代．据报道海洋沉积物来源的真菌中抗细菌、抗病毒、抗细胞毒等活性物质的化合物类型有肽类、聚酮类、生物碱、萜类等[2-5]．本实验以哈茨木霉为研究对象,该种木霉的部分菌株具有重要的生物防治作用[6],含有萜类化合物种类繁多、结构多样,并具有重要的生理、药理作用[7]．对其进行大规模发酵分离鉴定得到5个萜类化合物．作者选取水产养殖业中危害巨大的灿烂弧菌 (Vibrio splendidus)、哈维氏弧菌 (Vibrio harveyi)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)3种弧菌进行抑菌活性检测, 其中化合物I和V对鳗弧菌显示出了较好的抑制作用．1 实验1.1 材料、试剂与仪器有机溶剂(甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯),上海国药集团化学试剂有限公司;Sephadex LH-20 凝胶,瑞典乌普萨拉 GE Healthcare公司;200～300目硅胶粉、GF-254 硅胶板,青岛海洋化工有限公司; Bruker Avance III 500型超导核磁共振波谱仪 (TMS为内标),美国 Bruker 公司;2216E液体培养基,青岛高科园海博生物技术有限公司;供试弧菌由中国科学院烟台海岸带研究所生态毒理实验室提供．1.2 方法1.2.1 菌株分离从渤海湾R5站位(N 38°30'22", E 120°45'30")采集回沉积物泥样约100 g置于灭菌海水中,待沉积物颗粒完全沉降后,吸取200 μL上清液,涂布在土豆培养基平板上,25 ℃恒温培养得到一株哈茨木霉R5-1．土豆培养基:土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L,甘露醇6.63 g/L,蔗糖6.63 g/L,味精3g/L,CaBr2 0.3 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母浸粉5 g/L．海水配置,pH值8.0～8.5之间．1.2.2 菌种鉴定及保藏通过结合生物形态学以及遗传学ITS基因测序综合判断,菌株R5鉴定为哈茨木霉Trichoderma harzianum[8]．该菌种由中国科学院烟台海岸带研究所海洋天然产物与药物化学实验室分得,现保藏在中国科学院烟台海岸带研究所．1.2.3 菌株的发酵及其产物的分离与纯化将保种好的R5-1菌株接种在上述土豆固体培养基上进行活化,约接种20个左右的平板培养基28 ℃培养1～3 d;待菌株铺满整个平板后将平板培养基切至4～8块分别置于1 000 mL的锥形瓶中加入300 mL液体土豆培养基中进行发酵培养．本实验发酵培养了共100瓶,共计30 L发酵培养液．粗提物的提取:将发酵好菌株加入乙酸乙酯杀菌、过滤．菌液用乙酸乙酯萃取,减压浓缩得到菌液提取物．菌丝体风干,粉碎,用二氯甲烷-甲醇(1∶1)提取3次得到菌丝体提取物．将两者合并得到10.8 g总粗提物．将得到的粗提物进行硅胶柱层析进行分离,用石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱得14个组分(Fr. 1—Fr. 14),其中Fr. 6 (石油醚-乙酸乙酯2∶1)组分经反相硅胶柱层析(甲醇-水4∶3)得到化合物I (14.8 mg)．甲醇相得到Fr. 6-1组分,再经反相柱层析(甲醇-水)、硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯1∶1)得到化合物II (3.6 mg)和III (7.2 mg)． Fr. 7 (石油醚-乙酸乙酯1∶1)组分经制备薄层层析(二氯甲烷∶甲醇15∶1)得到化合物IV (2.0 mg)和V (2.1 mg)．1.2.4 化合物结构鉴定运用1H NMR、13C NMR等波谱技术手段,以及对比参考文献数据,对所得化合物的结构进行鉴定．1.2.5 化合物抑菌活性测试抗细菌活性测试采用纸片扩散法．供试菌株:灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum),阳性对照:氯霉素．将保种的细菌活化后接种于2216E固体培养基上,37 ℃培养12 h后,用接种环挑取少量菌落进行液体培养,12 h后用无菌枪头吸取约200 μL细菌悬液加入提前准备好的2216E固体培养基中,涂布均匀．将配好的化合物(4 mg/mL)吸取5 μL加到滤纸片上,放置于涂布好的平板中,正面向上置于37 ℃培养12 h[9],用刻度尺量出抑菌圈直径并记录．2 结果与讨论2.1 化合物I—V波谱数据化合物I:无色油状;C20H34O2;1H NMR谱数据(500 MHz, CDCl3):δH 4.17 (1H, dd, 10.0 Hz,3.8Hz, H-8), δH 2.61 (1H, dt, 19.8 Hz,6.2Hz, H-7a), δH 1.17 (3H, s, H-12), δH 1.13 (3H, s, H-16), δH 1.17 (3H, d,7.1Hz, H-13), δH 0.97 (3H, s, H-15),δH 0.90 (3H, s, H-14)．13C NMR谱数据(125 MHz):δC 73.8 (C-3, C), δC 72.7 (C-8, CH), δC 51.6 (C-9, CH), δC 52.1 (C-10b, CH), δC 43.3 (C-2a, CH), δC 43.4 (C-1, CH2), δC 41.0 (C-7, CH2), δC 40.2 (C-10, CH2), δC 40.1 (C-4, CH2), δC 38.4 (C-10a, C), δC 38.3 (C-11, C), δC 37.0 (C-5a, C), δC 25.6 (C-6, CH), δC 27.2 (C-5, CH2), δC 26.1 (C-15,CH3), δC 25.8 (C-16, CH3), δC 22.9 (C-13, CH3), δC 21.2 (C-2, CH2), δC 20.5 (C-12, CH3), δC 18.8 (C-14, CH3)．经文献对比,化合物I的1H和13C NMR显示与化合物wickerol B[10]的数据一致．化合物II:无色油状;C15H24O2;1H NMR谱数据(500 MHz, CDCl3):δH 6.85(1H, dd, 4.7 Hz, 3.5 Hz, H-9), δH 4.25 (2H, brs, H-15), δH 2.75 (1H, dt, 20.5 Hz, 1.6 Hz, H-10a), δH 2.39, 2.32 (2H, d, 16.9 Hz, 17.5 Hz, H-6), δH 2.21 (1H, dd, 21.1 Hz, 4.9 Hz, H-10b), δH 1.71(3H, m,H-2/3/4), δH 1.62 (1H, m, H-11), δH 1.38 (2H, m, H-1/2), δH 0.98 (3H, d, 6.7 Hz, H-14), δH 0.86 (3H, d, 8.5 Hz, H-12), δH 0.85 (3H, d, 8.4 Hz, H-13)．13C NMR谱数据(125 MHz):δC 201.7 (C-7, C), δC 146.4 (C-9, CH2), δC 137.5 (C-8, C), δC 62.3 (C-15, CH2), δC 60.0(C-1, CH),δC 47.9 (C-5, C), δC 47.6 (C-4, CH), δC 39.0 (C-6, CH2), δC 37.5 (C-10, CH2), δC 30.0 (C-3, CH2), δC 29.3 (C-11, CH), δC 25.7 (C-2, CH2), δC 24.2 (C-13, CH3), δC 21.8 (C-13, CH3), δC 16.5 (C-14, CH3)．经文献对比,化合物II的1H和13C NMR显示与化合物15-hydroxyacorenone ((1S,4S,5S)-8-hydroxymethyl-1-isopro pyl-4-Methylspiro[4.5]dec-8-en-7-o ne)[11]的数据一致．化合物III:无色油状;C15H28O2;1H NMR谱数据(500 MHz, CDCl3):δH 5.10 (1H, dt, 7.1Hz, 1.2Hz, H-10), δH 2.03 (1H, m, H-9), δH 1.83 (1H, m, H-6), δH 1.66 (3H, s, H-12), δH 1.60 (3H, s, H-15), δH 1.48 (2H, t, H-8), δH 1.23 (3H, s, H-13), δH 1.14 (3H, s, H-14), δH 1.01 (3H, d, 6.9Hz, H-1)．13C NMR谱数据(125 MHz): δC 130.8 (C-11, C), δC 123.5 (C-10, CH), δC 80.3 (C-3, C), δC 73.9 (C-7, C), δC 53.3 (C-6, CH), δC 43.2 (C-2, CH), δC 39.4 (C-8, CH2), δC 41.4 (C-4, CH2), δC 27.1 (C-13, CH3), δC 24.8 (C-12, CH3), δC 27.0 (C-5,CH2),δC 23.3 (C-14, CH3), δC 23.7 (C-9, CH2), δC 16.7 (C-15, CH3), δC 13.5 (C-1, CH3)．经文献对比,化合物III的1H和13C NMR显示与化合物cyclonerodi[12]的数据一致．化合物IV:无色油状;C15H29O3;1H NMR谱数据(500 MHz, CDCl3):δH 3.58 (1H, m, H-10), δH 1.16 (3H, s, H-13),δH 1.31 (3H, s, H-12/15), δH 1.08 (3H, s, H-14), δH 1.12 (3H, s, H-12/15), δH 1.06 (3H, d, 6.8 Hz, H-1)．13C NMR谱数据(125 MHz):δC 86.7 (C-10, CH), δC 86.5 (C-7, C), δC 81.3 (C-3, C), δC 70.6 (C-11, C), δC 54.9 (C-6, CH), δC 45.3 (C-2, CH), δC 40.7 (C-6, CH2), δC 36.9 (C-8, CH2), δC 27.7 (C-12/15, CH3), δC 27.8 (C-13, CH3), δC 26.0 (C-9, CH2),δC 26.1 (C-14, CH3),δC 24.5 (C-5, CH2), δC 29.2 (C-12/15, CH3), δC 12.7 (C-1, CH3)．经文献对比,化合物IV的1H和13C NMR显示与化合物epicycloneodioloxide[13]的数据一致．化合物V:无色油状;C15H29O3;1H NMR谱数据(500 MHz, CDCl3):δH 3.65(1H, t, 7.3 Hz, H-10),δH 1.75 (3H, s, H-13),δH 1.11 (3H, s, H-12/15), δH 1.12 (3H, s, H-14),δH 1.03 (3H, s, H-12/15),δH 1.13 (3H, d, 6.8 Hz, H-1)．13C NMR谱数据(125 MHz):δC 84.8 (C-7, C), δC 81.5 (C-10, CH), δC 80.2 (C-3, C), δC 71.4 (C-11, C), δC 57.9 (C-6, CH), δC 45.8 (C-2, CH), δC 40.7 (C-6, CH2),δC 35.1 (C-8, CH2),δC 26.3 (C-12/15, CH3),δC 27.1 (C-9, CH2), δC 27.3 (C-14, CH3), δC 24.7 (C-13, CH2), δC 22.5 (C-5, CH3), δC 26.2 (C-12/15, CH3), δC 13.9 (C-1, CH3)．经文献对比,化合物V的1H和13C NMR显示与化合物cycloneodiol oxide[13]的数据一致．根据波谱数据,确定化合物I—V的化学结构如图1所示．图1 化合物I—V的结构式Fig.1 Structures of compounds I-V2.2 化合物抗弧菌生物活性测定结果抗细菌活性如表1所示,对分离得到的化合物I—V进行了抗弧菌活性测试,在测试了3株弧菌:灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)后,测试结果显示,化合物I—V(20 μg/片)均对鳗弧菌表现出了不同程度的抗菌活性,对哈维氏弧菌与鳗弧菌并无抑制作用,化合物I和V对鳗弧菌的抑制作用尤为明显,其中化合物I抗鳗弧菌滤纸片抑菌圈直径为11.4 mm,化合物V抗鳗弧菌滤纸片抑菌圈直径为10.3 mm．表1 化合物I—V的抗弧菌活性结果(4 mg/mL)Tab.1 Antibacterial Activities of Compounds I-V (4 mg/mL) mm弧菌抑菌圈直径IIIIIIIVV氯霉素Vibrio anguillarum11.4±0.126.2±0.136±0.108.5±0.2110.3±0.2218.3±0.01 Vibrio splendidus-----19.7±0.51 Vibrio harveyi-----18.7±0.013 讨论从采集自渤海沉积物样品中分离得到一株海洋真菌哈茨木霉R5-1,对其扩大发酵结合硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、反相硅胶柱层析、制备薄层层析等分离手段分离得到5个萜类化合物wickerol B (I)、15-hydroxy acorenone ((1S,4S,5S)-8-hydroxymethyl-1-isopropyl-4-hethylspiro[4.5]dec-8-en-7-one) (II)、cyclonerodi (III)、epicycloneodiol oxide (IV) 和cycloneodiol oxide (V)．本文中分离所得化合物I—V状态均为油状,而参考文献中报道化合物II[11]为无定形固体结构,化合物V[13]为针状固体结构与文中描述状态有偏差,特此说明:由于在化合物的分离过程中化合物分离出时的温度的不同、去除溶剂的方法不同,如自然状态下晾干、用旋转蒸发仪蒸干均会引起最终化合物的状态呈现不同,故通过核磁共振图谱及对比文献数据确定其结构．弧菌一直为水产养殖中的主要致病菌来源,每年有大部分养殖产业深受其害,如在水产养殖过程中有一条仔鱼感染将会迅速蔓延至整个鱼塘,造成不可估量的经济和资源损失．萜类化合物在天然产物领域中一直扮演着具有良好生理活性的化合物结构类型的角色[14],具有抗寄生虫、抗肿瘤、抗细菌、抗各种酶等活性,其中也不乏被用来作为海洋药物的先导化合物用于实际产业应用．化合物I—V对抗海洋来源弧菌的活性测试结果显示,5个化合物均显示出对鳗弧菌有抑制作用,其中化合物I和V显示出了较好的活性．此研究丰富了萜类化合物抗弧菌活性的研究,也为抗弧菌海洋药物研发做出了初步探索,以期为将来进一步研究提供导示作用．参考文献:【相关文献】[1] 徐同，钟静萍，李德葆. 木霉对土传病原真菌的拮抗作用[J].植物病理学报, 1993, 23(1): 63-67.[2] LIN D, LI D, ZHU T, et al. 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