当前位置：文档之家 › 胰蛋白酶抑制因子的活性测定方法

胰蛋白酶抑制因子的活性测定方法

  • 格式：pdf
  • 大小：703.39 KB
  • 文档页数：2

Tro缓 冲溶液 ,在 涡旋搅
拌器 上 搅拌 3min,然 后加入 10.00ml Tro缓 冲溶液 t室 涅 下静止 10min,待 大部 分固体絮状 物质凝集下来后用滤纸过滤 (豆 粕样 品提取液再用 Tr。 缓冲溶液稀释 0o或 zO倍 )c
4反 应
4,1样 品空 白和试剂 空 白:分 别将 2.00ml样 品稀释液和 2.∞ ml蒸 镭水加 入 1omI试 管 中 。
备注 :由 于分析操作存在难 以避免 的随机误差 ,造 成 同一 样 品在不 同时间 (人 )检 测 时产 生 偏差 ,为 避免分析过程 中的随机实验误 差 ,我 们提示您用 同一 豆粕 样 品做参 比对照 。
■
胰蛋 白酶抑制因子活性测定方法
1原 理
胰蛋 白酶抑制剂 能够 和骧蛋 白酶结合 ,通 过 测定底物
(BAPA)被 未结合 的胰 蛋 白酶酶
解生成 的 产物一对硝基苯孩溶液 妁吸光 度 ,然 后 以它和未加抑制剂 的标准吸光度之差来表示 被抑制 的胰蛋 白酶活性
c
2材 料
2.1Tro缓 冲溶液 :溶 解 6.050g羟 甲基 氨墓 甲烷 itHs)和
试管 内 ,加 入
5。
2,∞ mI稀 释液于 10ml
00ml BAPA溶 液后在 37℃ 下保温 ⒛ min,加 入 2.∞ ml猪 咦蛋 白酶溶液 ,然 后
在水浴 中保温 10min,再 加
1m13o%醋 酸溶液 中止反应 。
5测 量
在
3gsnm(或 410nm)下 用试剂空 自校零和测定标准 、样 品和样 品空 白的吸光值 ,计
在 夕 ℃下保温 ⒛ min,各 加入 5,00ml BAPA溶 液 ,混 合 后在 37℃ 下 倮温 10min,分 别加入
1,00mI30%醋 酸溶液 中止反应 ,混 合均匀后各加入 2.∞ m丨 用 Tr。 缓冲溶液稀释 的猪胰蛋 白
酶溶液 。
4.2样 品和标准 :分 别吸取 2.00mlT"s缓 冲溶液 (作 标准 )和 3份
水 中 ,用 4.00moVL盐 酸调整
2.阢Og CaC砬 ・ H20于 gO0.00ml
pH至
8.zO、
再 雨水砖释至 10∞ ml。
(s启
2.2BAPA溶 液 :0.∝ Og的 苯 甲酰-DL-精 氨酸-B-砖 基菩 苯氨 ,用 预热到 歹 ℃ 的 Tris缓 冲溶液稀释到 1∞ m丨 ,现 配现 用 。
2.3猪 胰 蛋 白酶溶液 :称 取 0,100g猪 胰蛋 白酶 sigma)溶 于 zO.∞ mI 0。 ∞ 1moVL盐 酸
作为储备液 ;取
2。
00ml储 备液用 Tr。 缓冲溶液稀释至 1∞ mI=
2.430%醋 酸溶液 :称 量取 30.00m丨 冰醋酸用水稀释至 1∞ m|。
3样 品制备
在 sOml试 管 中称入过 gO目 筛 的豆粕 0.500g,并 加入 1o.∞ m丨
1
算每 ml稀 释液读数减去其空 白读数之后 与标准读数之 间的差值 。规 定吸光值减少 0,01为
6
个胰蛋 白酶抑制剂单位
(Ⅱ U)。
胰 蛋 白酶抑制剂含量 ΠU/g=((样 品 oD3gsnm~样 品空 白 oD3gsnm)^标 准液 oD3:5nm) × 稀释倍数 N/((— 0.01)× 0.5)

合集下载

_1_抗胰蛋白酶生物活性测定影响因素探讨

_1_抗胰蛋白酶生物活性测定影响因素探讨

α12抗胰蛋白酶生物活性测定影响因素探讨祝慈芳　朱　威(上海生物制品研究所,上海200052) 摘要:目的　研究分析用合成基质法测定α12抗胰蛋白酶生物活性时的影响因素。

方法　在α12抗胰蛋白酶中分别加入不同浓度的聚乙二醇(PEG,分子量4000),蔗糖,枸橼酸钠,乙醇,测定其生物活性。

结果　当PEG浓度接近20%时,α12抗胰蛋白酶生物活性与对照比增加近100%左右。

结论　PEG影响α12抗胰蛋白酶生物活测定。

关键词:α12抗胰蛋白酶　胰蛋白酶　BAPNA　聚乙二醇　蔗糖　枸橼酸钠　乙醇中图分类号:Q556+19　R392133　O6231413 文献标识码:A 文章编号:10042549X(2004)0420243204F actors influencing the assay ofα12antitrypsin bioactivity　ZHU Cif ang,ZHU Wei.S hanghai Institute of Biological Products,S hanghai200052,ChinaAbstract:Objective　To study the factors influencing the assay ofα12antitrypsin(α12A T)bioactivity.Methods　Var2 ious concentrations of PEG(MW,4000),sucrose,sodium citrate and ethanol were added before determiningα12A T activi2 ty.R esults　α12A T activity increased approximately100%compared with the controls when the PEG concentration reached20%.Conclusion　PEG concentration influences theα12A T activity assay.K ey w ords:α12antitrypsin;Trypsin;PEG;Sucrose;S odium citrate;Ethanol α12抗胰蛋白酶(alpha21antitrypsin,α12A T),又称蛋白酶抑制剂,是一种血浆糖蛋白,作为体内最重要的蛋白酶抑制物,在体内抑制蛋白酶活性中90%是由α12A T承担,主要抑制胰蛋白酶和嗜中性弹性蛋白酶的活性,能保护正常细胞不受蛋白酶的破坏和损害,可抑制感染和炎症,起到维持机体内环境稳定的作用[1]。

实验六胰蛋白酶活力的测定

实验六胰蛋白酶活力的测定


稀释后Ty（μg/ml） 0
20
40
60
80
100
Na2CO3(ml) 酚试剂(ml)
A680nm
5
5
5
5
5
5
1
1
1
1
1
1
迅速混合，于40℃放置15分钟
调0
以酪氨酸浓度μg/ml数为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。
2、蛋白酶活力的测定
管号
1号(样 品) 2号(对 照)
酶液 （ml）
1
A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K ：标准曲线上光吸收为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（分），本实验 t =10 ； V ：酶促反应管的总体积（毫升数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:2000
五、思考题
酶的试验为何设对照又要设空白 稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原
因。 如何保证本实验测定数据的准确性？
2．所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质.酚 试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物， 它在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产 生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物,680nm）
3．用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而 推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算胰 蛋白酶的活力。
4.蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下， 水解酪蛋白每分钟产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
721 型分光光度计 Folin 试剂甲液，乙液 0.5% 酪蛋白 100 μ g/mL Tyr 溶液
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
胰蛋白酶的制备及活力的测定

胰蛋白酶的制备及活力的测定

目的要求（1）学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的大体方式。

（2）了解酶的活性与比活性的概念。

实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生必然改变后转变成有活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为，最适～，在pH=3时最稳固，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。

Ca2+离子对胰蛋白酶有稳固作用。

重金属离子，有机磷化合物和反映物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。

最近发此刻一些植物的块基（如马铃薯、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，关于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。

另外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。

胰蛋白酶对这些键的灵敏性顺序为：酯键> 酰胺键> 肽键。

因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。

目前经常使用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。

用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。

本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。

酶活力单位的规定常因底物及测定方式而异。

从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一样是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提掏出来，然后再依照等电点沉淀的原理，调剂pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白和非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白和非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。

豆制品中胰蛋白酶抑制剂的研究

豆制品中胰蛋白酶抑制剂的研究

·食品科技·豆制品中胰蛋白酶抑制剂的研究杨丽杰吴非霍贵成孙占海（东北农业大学）【摘要】对豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性进行了调查，发现水解蛋白、乳用蛋白、组织蛋白、水豆腐、干豆腐中胰蛋白酶抑制剂活性均被钝化了以上；对腐乳、豆酱中胰蛋白酶抑制剂活性进行检测，结果未检出。

无糖豆粉、豆粉、豆浆以及内酯豆腐中胰蛋白酶抑制剂钝化率低于。

比较了种热处理方式对胰蛋白酶抑制剂的钝化效果，得到巴氏杀菌可钝化胰蛋白酶抑制剂；高压杀菌可钝化，超高温灭菌可钝化。

【关键词】豆制品；胰蛋白酶抑制剂；热处理中图分类号：文献标识码：文章编号：（）大豆营养价值高，是人和动物的主要蛋白质来源，但其中含有胰蛋白酶抑制剂，有碍营养素的吸收，导致食用后身体不适或豆制食品感官上的缺陷，严重时会造成人或动物的死亡。

豆制品中胰蛋白酶抑制剂的存在还没有引起人们足够的重视。

目前失活胰蛋白酶抑制剂主要采用热处理，为达到彻底钝化而采用的过度加热可使大豆中的蛋白质溶解度降低，营养物质遭到破坏。

而且，胰蛋白酶抑制剂比较耐热，热处理的效果也很有限。

本研究对市场上多种豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性进行了测定调查，比较了常用热处理方式对胰蛋白酶抑制剂的钝化效果，有利于人们对豆制品安全性的认识，为更彻底地失活胰蛋白酶抑制剂提供依据。

材料与方法材料与设备腐乳、干豆腐、内酯豆腐、豆浆、水豆腐、豆酱、豆粉为市售；无糖豆粉、水解蛋白、乳用蛋白、组织蛋白为大豆蛋白食品公司提供；生豆粉为实验室自备；所用化学试剂为分析纯或生化试剂。

牛胰蛋白酶、、均由美国公司生产。

仪器设备：振荡培养箱（上海医用仪表厂）、离心机（北京医用离心机厂）、型凯氏定氮仪（北京宜兴科教仪器研究所）、多功能恒温水浴锅型（沈阳市医疗器械厂）、紫外可见分光光度计型（日本岛津公司）、高压灭菌器（上海医用核子仪器厂）。

试验方法豆制品中常规营养成分测定d水分含量测定：常压干燥法。

i粗蛋白测定：微量凯式定氮法。