下载文档原格式
α1抗胰蛋白酶突变体ATZ过表达增强细胞自噬水平朱娜;冯利杰;王海萍;沈玉君;沈玉先【摘要】目的：观察α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）Z型突变体（α1-antitrypsin Z variant，ATZ）表达对细胞自噬水平的影响，探讨ATZ细胞毒作用的可能机制。
方法体外培养人胚肾细胞株HEK 293T并转染ATZ真核表达质粒，利用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达，免疫荧光染色观察LC3的细胞定位，real-time PCR法检测自噬相关基因Atg5、Atg12和Beclin1的变化，DAB染色观察ATZ过表达对细胞形态的影响。
结果与转染空质粒对照组相比，%Aim To investigate the effect of α1-anti-trypsin Z variant (ATZ)overexpression on cell autoph-agy.Methods HEK 293T cells were transfected with pcDNA3.1 zeo+/ATM or pcDNA3.1 zeo+/ATZ,e-qual amount of empty vector was used as control.Cells were treated with NH4Cl for 4 hours and processed for detecting ATZ,LC3 and p62 by immunoblot.Mean-while ,expression and intracellular localization of ATZ, LC3 in 293 T cells were observed with double labeled immunofluorescence.The mRNA levels of autophagy-related genes were measured by real-time PCR.Immu-nohistochemistry was used to observe the morphology of ATZ-positive cells.Results Compared with the control,higher LC3Ⅱ levels and LC3 puncta were ob served in ATZ transfected cells.Meanwhile,the levelsof p62 were decreased in ATZ transfected cells,andreversed by NH4 Cl (25 mmol·L -1 )treatment.Over expression of ATZ increased the mRNA levels ofAtg5and Atg12,but had no obvious influence onBeclin1.ATZ overexpressing cells presented abnormalmorphol ogies.The nuclei became reduced,condensed,and e ven disappeared in ATZ positive cells.Conclusion ATZ overexpression increases autophagy activity whichmay be related to increasing Atg5 and Atg12 levels.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2014(000)007【总页数】5页(P921-925)【关键词】α1 抗胰蛋白酶 Z 型突变体;自噬;p62;LC3;Bec-lin1;细胞毒性【作者】朱娜;冯利杰;王海萍;沈玉君;沈玉先【作者单位】安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032; 安徽医科大学生物药物研究所，安徽合肥 230032;安徽医科大学基础医学院，安徽合肥 230032; 安徽医科大学生物药物研究所，安徽合肥 230032;安徽医科大学基础医学院，安徽合肥 230032; 安徽医科大学生物药物研究所，安徽合肥 230032;安徽医科大学生物药物研究所，安徽合肥 230032;安徽医科大学基础医学院，安徽合肥230032; 安徽医科大学生物药物研究所，安徽合肥 230032【正文语种】中文【中图分类】R329.24;R329.25;R345.3;R394.2;R977.3;R977.6α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）属于丝氨酸蛋白酶超家族成员，由肝细胞合成和分泌，可以抑制包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶等多种蛋白酶活性，但其主要作用是通过血液循环扩散到肺部，保护肺组织弹力纤维免受中性粒细胞弹性蛋白酶的水解和破坏［1］。
初级临床医学检验技士专业知识模拟试卷30(总分：200.00，做题时间：90分钟)一、 A1型题(总题数：71，分数：142.00)1.下列哪项属于溢出性蛋白尿（分数：2.00）A.白蛋白B.小分子蛋白C.本周蛋白√D.糖蛋白E.脂蛋白解析：解析：肾小球滤过功能和肾小管重吸收功能均正常，因血浆中相对分子质量较小或阳性电荷蛋白异常增多，经肾小球滤过，超过肾小管重吸收能力所形成的蛋白尿，称为溢出性蛋白尿。
如本周蛋白、游离血红蛋白、肌红蛋白等。
2.产AmpC酶的革兰阴性杆菌对哪种药物敏感（分数：2.00）A.青霉素B.三代头孢菌素C.氨曲南D.四代头孢菌素√E.舒普深解析：解析：Ampc酶属于BushI型酶，对青霉素、舒普深、三代头孢菌素及氨曲南耐药，对亚胺培南及四代头孢菌素敏感。
3.下列选项中不属于化学发光免疫测定发光剂的是（分数：2.00）A.吖啶酯B.鲁米诺C.三联吡啶钌D.AMPPDE.碱性磷酸酶√解析：解析：碱性磷酸酶属于化学发光反应中的催化剂。
4.下列哪项红细胞平均血红蛋白浓度升高（分数：2.00）A.急性失血性贫血B.珠蛋白生成障碍性贫血C.肾性贫血D.口形红细胞增多症E.球形红细胞增多症√解析：解析：红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)反映每升红细胞中所含血红蛋白浓度，MCHC增高可见于球形红细胞增多症。
5.下列哪项可引起真菌性脑膜炎（分数：2.00）A.组织胞浆菌B.毛霉菌C.曲霉菌D.新生隐球菌√E.念珠菌解析：解析：新生隐球菌可经呼吸道侵入人体。
由血流播散至脑及脑膜，引起隐球菌性脑膜炎。
6.下列选项中浆膜腔积液中浆细胞增高的是（分数：2.00）A.充血性心力衰竭√B.肺梗死C.结核性积液D.膈下脓肿E.化脓性积液解析：解析：浆膜腔积液中浆细胞增高可见于充血性心力衰竭、恶性肿瘤或多发性骨髓瘤浸润浆膜所致积液。
7.下列哪项反映精子活力a级（分数：2.00）A.快速前向直线运动√B.慢速或呆滞前向运动C.非前向运动D.不规则运动E.不动解析：解析：精子活动分四级：a级：快速前向直线运动；b级：慢速或呆滞前向运动；c级：非前向运动：d级：不动。
血浆蛋白质检查一、主要血浆蛋白质的理化性质、功能和临床意义（一）血浆蛋白质的组成包括前白蛋白、白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、结合珠蛋白、α2-巨球蛋白、铜蓝蛋白、转铁蛋白、β2-微球蛋白、C-反应蛋白。
（二）功能和临床意义1.前清蛋白（PA）：又称前白蛋白。
由肝细胞合成，其半寿期很短，仅约2～5天。
（1）功能1）参与组织修补。
2）运载蛋白：运输激素和维生素，如运输甲状腺激素和维生素A。
（2）临床意义1）营养不良指标。
2）肝功不全指标：在肝炎发病早期血清前白蛋白浓度下降往往早于其他血清蛋白成分的改变。
3）急性炎症、恶性肿瘤、肾炎时其血清浓度降低。
2.清蛋白（Alb）由肝实质细胞合成，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的57%～68%。
（1）功能①内源性氨基酸营养源；②维持血液正常pH；③血浆中主要的非特异性载体，可运输许多水溶性差的物质如胆红素、胆汁酸盐、前列腺素、类固醇激素、金属离子、多种药物等；④维持血液胶体渗透压。
（2）临床意义1）个体营养状态的评价指标：医学认定水平：Alb＞35g/L时正常（人卫教材有误，按此数值记忆）；28～34g/L轻度缺乏；21～27g/L 中度缺乏；＜21g/L严重缺乏。
当清蛋白浓度低于28g/L时，会出现水肿。
2）在血浆蛋白质浓度明显下降的情况下，可以影响许多配体在血循环中的存在形式，包括内源性的代谢物、激素和外源性的药物。
3）浓度升高：严重脱水、休克、饮水不足时。
4）浓度降低摄入不足（营养不良）合成障碍（慢性肝病）消耗增大（恶性肿瘤、甲亢、重症结核等）丢失增多（肾病综合征、严重烧伤、急性失血、组织炎症等）白蛋白分布异常（门静脉高压腹水）先天性白蛋白缺乏症（罕见）3.α1-酸性糖蛋白（AAG）：又称血清类黏蛋白，包括等分子的己糖、己糖胺和唾液酸。
临床意义：主要作为急性时相反应的指标。
增高：风湿病、恶性肿瘤及心肌梗死患者常增高。
降低：在营养不良、严重肝损害等情况下。
《医学生物化学》试题（含答案）（适用于医学、药学本科及高职高专各专业）(3)一、单选题（共60题，90分）1、以下哪个疾病是由于血红蛋白构象改变引起的A、地中海贫血B、白化病C、夜盲症D、败血症E、镰刀形红细胞贫血正确答案： E2、呼吸链中,不与其他成分形成蛋白复合体的是A、 Fe-SB、黄素蛋白C、细胞色素c1D、细胞色素bE、细胞色素c正确答案： E3、严重糖尿病可危及生命的主要原因是A、葡萄糖从尿中排出过多B、代谢性酸中毒C、消瘦D、丙酮过多E、脂酸不能氧化正确答案： B4、胰蛋白酶原经胰蛋白酶作用后切下六肽，使其形成有活性的酶，这一过程称为A、别构效应B、酶原激活C、诱导契合D、正反馈调节E、负反馈调节正确答案： B5、下列哪一项是抑癌基因A、 rasB、 sisC、 p53D、 srcE、 myc正确答案： C6、形成DNA和RNA分子的化学键是A、糖苷键B、氢键C、 3', 5'-磷酸二酯键D、 1', 3'-磷酸二酯键E、 2', 5'-磷酸二酯键正确答案： C7、稳定DNA双螺旋的主要因素是A、氢键与碱基堆积力B、与钠离子结合C、 DNA与组蛋白结合D、与镁离子结合E、肽键正确答案： A8、ATP形成的主要方式是A、糖原磷酸化B、肌酸磷酸化C、产物水平磷酸化D、底物水平磷酸化E、氧化磷酸化正确答案： E9、酶促反应动力学中，研究影响酶促反应速度的因素中不包括A、底物的浓度B、酶的浓度C、反应的pH值D、湿度E、反应温度正确答案： D10、生物氧化的方式不包括A、 FADH2脱氢B、加氧C、失电子D、得电子E、 NADH+H+脱氢正确答案： D11、下列常用于PCR反应的酶是A、 DNA连接酶B、反转录酶C、末端转移酶D、 DNA聚合酶ⅠE、 Taq DNA聚合酶正确答案： E12、放线菌酮抗肿瘤作用机制是A、引起DNA链间交联、妨碍双链拆开B、插入DNA双链,破坏模板作用C、抑制细胞DNA聚合酶活性D、抑制细胞RNA聚合酶活性E、抑制蛋白质生物合成正确答案： E13、下列不属于受体与配体结合的特点A、高度专一性B、高度亲和力C、可饱和性D、不可逆性E、特定的作用模式正确答案： D14、真核细胞的转录主要发生在A、细胞质B、细胞核C、线粒体D、核糖体E、内质网正确答案： B15、下列不属于嘌呤核苷酸的抗代谢物是A、 6-巯基嘌呤B、 8-氮杂鸟嘌呤C、氮杂丝氨酸D、氨甲蝶呤E、 5-氟尿嘧啶正确答案： E16、下列哪一项反应不是在细胞质内进行A、脂肪酸合成B、磷酸戊糖途径C、脂肪酸β-氧化D、糖酵解E、糖原合成与分解正确答案： C17、关于葡萄糖有氧氧化的叙述,错误的是A、是细胞获能的主要方式B、有氧氧化的酶在细胞质和线粒体都有C、葡萄糖有氧氧化的ATP主要通过氧化磷酸化获得D、有氧氧化的终产物是二氧化碳和水E、供氧充足时,所有组织细胞的酵解作用均被抑制正确答案： E18、下列属于糖酵解关键酶的是A、 6-磷酸葡糖酶B、丙酮酸激酶C、柠檬酸合酶D、苹果酸脱氢酶E、葡糖-6-磷酸脱氢酶正确答案： B19、下列属于支链氨基酸的是A、 SerB、 GlyC、 LeuD、 MetE、 His正确答案： C20、底物浓度与反应速度的关系曲线是A、直线B、矩形双曲线C、抛物线D、 S形曲线E、钟罩型曲线正确答案： B21、蛋白质生物合成过程中氨基酸的活化方式是A、与ATP结合而被磷酸化B、与甲硫氨酸结合C、生成氨基酰辅酶AD、生成氨基酰-tRNAE、与起始因子结合正确答案： D22、胆汁酸的生理功能包括A、促进脂类消化和吸收B、转化成胆固醇C、帮助脂类物质运输D、维持体内酸碱平衡E、维持血糖水平正确答案： A23、将胆固醇从肝外组织逆向运往肝脏的是A、 CMB、 VLDLC、 LDLD、 IDLE、 HDL正确答案： E24、逆转录病毒复制成双链DNA需要由下列哪一种酶催化进行A、 RNA聚合酶B、 RNA复制酶C、 DNA聚合酶D、 DNA复制酶E、逆转录酶正确答案： E25、蛋白质营养价值的高低取决于A、氨基酸的种类B、氨基酸的数量C、必需氨基酸的种类D、非必需氨基酸的数量和种类E、必需氨基酸的种类、数量和比例正确答案： E26、提供嘌呤环N-3和N-9的化合物是A、谷氨酰胺B、丝氨酸C、丙氨酸D、甘氨酸E、天冬氨酸正确答案： A27、下列DNA序列属于回文结构的是A、 ATGCCG TACGGCB、 GGCCGC CCGGCCC、 CATAGGG GATCCCD、 GAATTC CTTAAGE、 TCTGAC AGACTG正确答案： D28、生物合成胆固醇和脂肪酸的原料是A、乙酰CoAB、丙二酰CoAC、乙酰乙酰CoAD、丙酮酸E、乳酸正确答案： A29、蛋白质胶体溶液不稳定的因素是A、溶液pH值大于pIB、溶液pH值小于pIC、溶液pH值等于10D、溶液pH值等于pIE、在水溶液中正确答案： D30、激素的第二信使不包括A、 PIP2B、 cAMPC、 DAGD、 Ca2+E、 IP3正确答案： A31、蛋白激酶所催化的蛋白质修饰反应是A、糖基化B、磷酸化C、乙酰化D、泛素化E、甲基化正确答案： B32、有关生物转化作用的描述,错误的是A、有些物质经过生物转化毒性增强B、肝是生物转化最重要的器官C、使非极性物质极性增强D、作用的实质是裂解生物活性物质E、使疏水性物质水溶性增加正确答案： D33、正常人尿中的主要色素A、胆红素B、胆素C、胆绿素D、胆汁酸盐E、血红素正确答案： B34、下列哪种物质含有高能磷酸键A、磷酸烯醇式丙酮酸B、乙酰CoAC、琥珀酰CoAD、 3-磷酸甘油E、 AMP正确答案： A35、苯丙氨酸在体内的主要代谢是经羟化作用生成下列哪种氨基酸A、丙氨酸B、酪氨酸C、组氨酸D、色氨酸E、甲硫氨酸正确答案： B36、二硝基苯酚属于氧化磷酸化的A、激活剂B、解偶联剂C、磷酸化抑制剂D、电子传递抑制剂E、氧化剂正确答案： B37、关于ATP在能量代谢中的作用,描述错误的是A、 ATP是体内最重要的高能磷酸化合物B、能量的生成、贮存、释放和利用都以ATP为中心C、 ATP的化学能可转变为电能、渗透能及热能等D、 ATP通过转移自身基团提供能量E、体内合成反应所需的能量均由ATP直接供给正确答案： E38、维生素B2在体内的活性形式是A、 TPPB、 NADP+C、 FMND、磷酸吡哆醛E、 FH4正确答案： C39、a1-抗胰蛋白酶(AAT)可抑制丝氨酸蛋白酶—弹性蛋白酶(elastase)的作用,如果AAT缺乏可导致肺气肿。
血清PGC -1α、A1AT 水平与2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病发病的关系吴军1，邓润钧1，张向磊1，贺倩倩1，姜莉莉21 青岛大学附属青岛市海慈医院（青岛市中医医院）消化中心，山东青岛266033；2 青岛大学附属青岛市海慈医院（青岛市中医医院）内分泌科摘要：目的 探讨血清过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂-1α（PGC -1α）、α1-抗胰蛋白酶（A1AT ）水平与2型糖尿病（T2DM ）合并非酒精性脂肪性肝病（NAFLD ）发病的关系。
方法 选取T2DM 患者184例（T2DM 组），另选取同期60名体检健康志愿者（对照组），根据是否合并NAFLD 将T2DM 患者分为NAFLD 组（95例）和非NAFLD 组（89例）。
采用酶联免疫吸附法检测血清PGC -1α、A1AT 水平。
多因素Logistic 回归分析影响T2DM 合并NAFLD 的因素，受试者工作特征曲线分析血清PGC -1α、A1AT 水平对T2DM 合并NAFLD 的预测价值。
结果 与对照组比较，T2DM 组血清PGC -1α、A1AT 水平降低（P 均<0.05）。
与非NAFLD 组比较，NAFLD 组血清PGC -1α、A1AT 水平降低（P 均<0.05）。
体质量指数增加、T2DM 病程延长、高血压和总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、谷草转氨酶、谷丙转氨酶升高为T2DM 合并NAFLD 的独立危险因素，高密度脂蛋白胆固醇、PGC -1α、A1AT 升高为独立保护因素（P 均<0.05）。
血清PGC -1α、A1AT 水平联合预测T2DM 合并NAFLD 的曲线下面积为0.885，大于血清PGC -1α、A1AT 水平单独预测的0.788、0.786（P 均<0.05）。
结论 血清PGC -1α、A1AT 水平降低与T2DM 合并NAFLD 发病密切相关，血清PGC -1α、A1AT 水平联合对T2DM 合并NAFLD 具有较高的预测价值。
serpina1基因作用
Serpina1基因是编码血清蛋白酶抑制剂A1（SERPINA1）的基因，也被称为α1-抗胰蛋白酶。
这个基因的主要作用是编码一种血清蛋
白酶抑制剂，它在体内的主要功能是抑制一些蛋白酶的活性，特别
是胰蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶。
这种抑制作用对于维持体内
蛋白酶和蛋白酶抑制剂的平衡至关重要，有助于防止过度的蛋白酶
活性。
此外，Serpina1基因的突变也与遗传性α1-抗胰蛋白酶缺乏症（AAT缺乏症）相关联。
AAT是一种肝脏产生的蛋白质，主要存在于
血液和组织液中，具有保护肺部免受蛋白酶介导的损伤的作用。
Serpina1基因的突变可能导致AAT蛋白质的异常折叠和聚集，最终
会引起肺部组织的损伤，导致慢性阻塞性肺病（COPD）和肝脏疾病
等症状。
此外，Serpina1基因还可能与其他疾病和生理过程有关，但具
体作用还需要进一步的研究来阐明。
总的来说，Serpina1基因的作
用涉及到蛋白酶抑制和与AAT缺乏症相关的生理过程，对于维持体
内蛋白酶和抑制剂的平衡以及保护肺部组织健康都具有重要意义。
α1-抗胰蛋白酶氨基酸序列α1-抗胰蛋白酶是一种具有抑制胰蛋白酶活性的蛋白质，是由119个氨基酸残基组成的多肽链。
它最早是在人血浆中被发现，因此也被称为血浆抗胰蛋白酶。
后来，它被发现存在于许多不同的物种和组织中，包括血清、肝脏、肾脏、胰腺、卵巢等。
α1-抗胰蛋白酶的氨基酸序列已经被确定，其总长度为419个氨基酸。
其中，前109个氨基酸被认为是一个信号肽，用于引导多肽链到细胞外部。
在信号肽之后，多肽链中的第110个氨基酸是亮氨酸（Leu），标志着多肽链的起始位置。
从这里开始，α1-抗胰蛋白酶的核心区域包含10个半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基形成了5个可重复的结构域。
这种结构域被称为“反式褶曲”，它具有一个内部反式褶曲对折，似乎是为了保持多肽链的稳定性。
这些结构域之间的连接区域是许多其他类型的氨基酸残基，包括丝氨酸（Ser）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）等。
α1-抗胰蛋白酶的结构域中，最具有生物学意义的是最后一个结构域，它包含了它的抑制胰蛋白酶活性的活性位点。
这个活性位点由三个残基组成，其中一个天冬氨酸残基（Asp），一个组氨酸残基（His）和一个丝氨酸残基（Ser）。
这些残基形成了一个环，被认为是抑制胰蛋白酶的关键。
值得注意的是，α1-抗胰蛋白酶的生物活性受到多种因素的影响，包括pH值、离子强度、温度等。
此外，不同的α1-抗胰蛋白酶同工酶的氨基酸序列有所不同，它们可能对不同的胰蛋白酶具有不同的亲和力和抑制能力。
总之，α1-抗胰蛋白酶的氨基酸序列具有高度的保守性，它的核心区域具有反式褶曲的结构域。
在其末端，一个包含抑制胰蛋白酶活性的活性位点的结构域起着关键作用。
这个氨基酸序列的特点使得α1-抗胰蛋白酶成为一种重要的蛋白质，参与到很多重要的生物进程中。
α1-抗胰蛋白酶在临床上的应用肺气肿是慢性阻塞性肺疾的一种，造成的原因是肺泡持续反复接受到不可逆的损伤，细胞修补结痂后组织内的弹性纤维被胶原（Collagen）取代，导致肺泡的弹性下降，气体交换容积减小，最后造成肺囊泡塌陷，气体滞留在肺内，而形成肺气肿。
肺气肿的疾病病程与肺部内的弹性蛋白酶（elasrase）有很大的相关性。
体内为避免某些蛋白酶过度活跃，进而造成组织伤害，体内会产生一些蛋白酶抑制剂(ptotease inhibitor)，和体内蛋白酶结合，以防止蛋白酶的过度作用并达到一个巧妙的平衡。
其中α1-antitrypsin(α1-抗胰蛋白酶，简称AAT)就是用来拮抗弹性蛋白酶的作用。
弹性蛋白酶是一种丝胺酸蛋白分解酶（serine protease），当嗜中性白血球受到外来抗原的刺激而产生。
它可以调解许多生理反应，如凝集反应与纤维蛋白溶解步骤。
而AAT是一个52KDα糖蛋白(glycoprotein)，合成于肝脏并发布于血液及肺部的组织间液中。
在正常血浆中的AAT浓度约20-53μM，而在肺部AAT 的含量需维持相当于弹性蛋白酶活性的90%以上。
且血浆中最低的有效浓度不可低于11μM，否则弹性蛋白酶会过度活化，进而造成不可逆的伤害。
有些人先天AAT活性不足或缺乏，使得弹性蛋白酶相对的过度活化，这些AAT缺损(deficiency)的患者与吸烟者一样都为肺气肿的高危险群，AAT缺损是一种遗传性疾病，这类患者体内的AAT基因功能异常，使得AAT的制造不足或活性变差，无法维持正常抑制蛋白酶的功能。
AAT缺损的首例在北欧发现，而在美国大约每2000-4000人就有一人是AAT缺损的患者。
若从流行病学来看，AAT缺乏且有烟瘾的患者会比不抽烟的伤害更大，气喘、下呼吸道感染、家族病史等，也会影响AAT 缺乏症的进展。
抽烟和环境中的部分物质会引发AAT的氧化、降低AAT的效用，而气喘及感染则会引起嗜中性白血球的活化导致弹性蛋白酶过度反应。
α1-抗胰蛋白酶对白蛋白—胰岛素结合抑制作用及其机制糖尿病是一种以血糖代谢紊乱为特点的常见慢性疾病,其中90%以上为2型糖尿病(type2diabetes, T2DM)。
近年来研究发现胰岛素抵抗在2型糖尿病发病中起重要作用,并贯穿于2型糖尿病全过程。
关于胰岛素抵抗的发生机制尚不完全清楚,各种实验研究结果显示,胰岛素抵抗的发生多是与炎症反应、激素因子作用、内质网应激以及过量的营养产物在胰岛素敏感组织堆积等共同作用有关。
妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是指在妊娠期首次发生或发现的不同程度的糖代谢异常。
GDM发病机制至今尚不清楚,它由多种因素作用所致,胰岛素抵抗和胰岛p细胞分泌降低是GDM发病机制的重要环节。
白蛋白是最主要的血浆蛋白之一,在大量内源性和外源性物质的结合和转运方面发挥重要的作用。
白蛋白具有胰岛素样或是抑制胰岛素样活性,而且血清中的胰岛素大多与血清蛋白相结合。
我们之前的研究结果表明：首先,在血清中存在两种不同形式的胰岛素即游离胰岛素和结合胰岛素。
游离胰岛素作为活性形式而结合胰岛素作为非活性形式存在；其次,血清白蛋白作为胰岛素的转运体和存储体；最后,白蛋白和胰岛素的结合与解离可以调节血糖水平和细胞功能。
根据以上三点,我们提出胰岛素抵抗发生机制的新设想：我们假设游离胰岛素是作为可供机体立即利用的活性形式,结合胰岛素则处于非活性状态,但可从结合蛋白质中分离从而保持游离胰岛素水平的稳定。
在某些病理状态下,例如高脂血症和肥胖时,这种平衡可以发生改变。
如果血清白蛋白-胰岛素结合力增加,则可供利用的游离胰岛素水平降低；相反,如果血清白蛋白-胰岛素结合力降低,由于游离胰岛素半衰期很短,则可供利用的游离胰岛素水平在餐后上升而在空腹水平时下降。
不论是在哪种条件下,胰腺都要分泌更多的胰岛素以维持血糖在空腹和餐后状态下的正常水平。
如果这种补偿机制失衡,则正常的空腹血糖水平无法维持。
因此,在我们接下来的研究中,将会着重探索影响白蛋白-胰岛素结合力的未知的病理因素及其是如何发挥作用的,从而为我们所提出的胰岛素抵抗的新设想以至糖尿病的发生机制提供进一步的理论依据。
我们的实验主要分为两部分：第Ⅰ部分：2型糖尿病与妊娠期糖尿病的蛋白质组学研究。
我们采用2型糖尿病病人和妊娠期糖尿病病人分别与其对照者的血清进行蛋白质组学研究,筛选出这两组病人与其对照在血清蛋白表达上的共同点,发现可能影响白蛋白-胰岛素结合力的重要因子。
12例2型糖尿病病人和10例匹配对照者的血清以及9例妊娠期糖尿病病人和8例匹配对照者的血清用来进行双向电泳,随后用软件对图谱进行分析和匹配,并对在两组中发生相同显著差异变化的4种蛋白质进行质谱鉴定。
结果显示：2型糖尿病病人和对照者血清蛋白质双向电泳图谱进行图像分析和匹配后发现,两种图谱的蛋白点数分别为465±11和423±15,其中共有269个蛋白点相互匹配,匹配率平均为61%。
在这些匹配的蛋白点中,共有19个蛋白点发生显著性差异变化(以3倍变化幅度为基准),其中在2型糖尿病中表达上调的蛋白点有8个,表达下调的蛋白点有11个。
对妊娠期糖尿病病人和其对照者血清蛋白质双向电泳图谱进行分析和匹配后发现,两种图谱的蛋白点数分别为325±18和342±10,其中共有197个蛋白点相互匹配,匹配率平均为59%。
在这些匹配的蛋白点中,共有30个蛋白点发生显著性差异变化(以3倍变化幅度为基准),其中在妊娠期糖尿病中表达上调的蛋白点有19个,表达下调的蛋白点有11个。
综合分析上述发生变化的蛋白点,我们发现有2个蛋白点在2型糖尿病和妊娠期糖尿病病人血清中均表达上调,同时也有2个蛋白点在这两组病人血清中均表达下调。
对这4种蛋白点的质谱鉴定结果显示它们分别为α1抗胰蛋白酶、血管紧张素原、凝集素和人血白蛋白与十四酸和三碘苯甲酸的复合物。
其中α1抗胰蛋白酶和血管紧张素原在两组糖尿病中表达下降,与对照组的相对表达量分别是-3.82±0.73和-4.76±0.33；而凝集素和人血白蛋白与十四酸和三碘苯甲酸的复合物在两组糖尿病中表达上升,与对照组的相对表达量分别是15.6±2.49和3.13±0.23。
第Ⅱ部分：α1抗胰蛋白酶对白蛋白-胰岛素结合力的影响。
在第Ⅰ部分的实验中,我们研究发现了在两组糖尿病病人中发生改变的4种蛋白质,其中a1抗胰蛋白酶在血清中的数量级最高,与白蛋白的分子数最为匹配,预计对白蛋白的结合或解离状态影响最大,因此,我们选择α1抗胰蛋白酶作为研究对象,观察其在影响白蛋白-胰岛素结合力方面所发挥的作用。
首先,我们用免疫共沉淀的方法去证明血清中白蛋白和α1抗胰蛋白酶的结合。
用α1抗胰蛋白酶的抗体去沉淀与之结合的蛋白,非特异IgG作为对照。
结果显示在α1抗胰蛋白酶抗体组可明显检测到α1抗胰蛋白酶,同时也可以检测到大量白蛋白；在非特异IgG组则未发现有α1抗胰蛋白酶。
然后,我们用体外实验证明不同浓度α1抗胰蛋白酶对白蛋白-胰岛素结合力的影响。
结果显示：与正常浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组相比,低浓度a1抗胰蛋白酶明显增加了结合胰岛素/游离胰岛素的比值(2.41±0.17vs1.76土0.20,P=0.0024)；低浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组和高浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组之间该比值更加明显(2.41士0.17vs1.53士0.18,P=0.0004)；而正常浓度al抗胰蛋白酶/白蛋白组和高浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组之间该比值没有统计学意义(P=0.1406)。
接下来,我们观察了白蛋白和胰岛素对小鼠血清α1抗胰蛋白酶浓度的影响。
结果发现在α1抗胰蛋白酶/白蛋白低于正常时,注射白蛋白可提高血清α1抗胰蛋白酶浓度,而α1抗胰蛋白酶/白蛋白正常或者高于正常时,白蛋白对α1抗胰蛋白酶浓度无影响。
相反,注射胰岛素可显著降低注射PBS或者少量(0.64mg/ml)α1抗胰蛋白酶小鼠的血清α1抗胰蛋白酶浓度。
由于免疫共沉淀结果显示血清中胰岛素与α1抗胰蛋白酶不结合,这就提示胰岛素与α1抗胰蛋白酶竞争结合白蛋白。
我们进一步观察白蛋白/α1抗胰蛋白酶比值对血糖浓度的影响,结果显示：低α1抗胰蛋白酶(0.64mg/ml)/白蛋白比值组中小鼠的血糖水平明显升高,阻止了胰岛素诱导的低血糖反应。
将注射液的αl抗胰蛋白酶的浓度增加到2.58mg/ml和10.30mg/ml后,胰岛素诱导的低血糖反应则出现加大且延长。
α1抗胰蛋白酶的浓度与血糖水平的变化呈现出负相关关系。
注射不含白蛋白的α1抗胰蛋白酶溶液则与注射正常和高α1抗胰蛋白酶/白蛋白比值组类似。
因此,我们认为α1抗胰蛋白酶通过抑制白蛋白和胰岛素的结合来发挥降血糖的作用。
我们首次发现α1抗胰蛋白酶可通过与胰岛素竞争结合白蛋白,促使胰岛素从胰岛素-白蛋白复合物中解离和利用,从而调节血糖水平。
低α1抗胰蛋白酶血症可能是2型糖尿病和妊娠期糖尿病胰岛素抵抗的重要机制,为糖尿病的发生和发展提供了新的机制,具有临床潜在应用价值。
昼夜节律生物钟(circadian clock)参与调控机体行为与各项生理功能。
昼夜节律的产生依赖于各种生物钟基因(clock gene)的转录-翻译反馈环路。
钟基因可以通过调节下游的钟控基因(CCGs)调节多项生理功能。
研究表明,昼夜节律生物钟不仅参与生理功能的调节,在多种病理过程中如心血管系统疾病、肿瘤中也发挥了重要的作用。
急性心肌梗塞(Acute Myocardial Infarction, AMI)是动脉粥样硬化的终末病变,其发病具有明确的昼夜节律,在早晨高发。
目前对这种现象发生的机制还未研究清楚,但可能与昼夜节律生物钟有关。
本研究将利用apoE基因敲除(apoE-/-)小鼠建立动脉粥样硬化模型,以研究动脉粥样硬化发病过程中动脉粥样硬化相关基因：纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(Pai-1)、组织因子(TF)、内皮素-1(ET-1)和基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-2及MMP-9)的昼夜节律表达变化,为研究动脉粥样硬化的发病机制提供新的理论依据。
apoE-/-小鼠心脏动脉粥样硬化相关基因表达节律的改变。
利用apoE-/-小鼠建立动脉粥样硬化早期及进展期动物模型。
使用3月龄apoE-/-小鼠48只,分为两组,每组24只,一组给予普通膳食,一组西方类型膳,以24只同龄雄性C57BL/6J作为对照,在12光照/12黑暗(12L/12D)环境中饲养4周。
根据Zeitgaber Time,分别在ZTO、ZT4、ZT8、ZT10、ZT12、ZT14、ZT16、ZT20八个时间点处死小鼠；取小鼠主动脉起始段做冰冻切片,油红O染色检测动脉粥样斑块；取小鼠心脏液氮速冻,-70℃冰箱保存。
利用Real-time RCR检测apoE-/-与C57BL/6J小鼠心脏动脉粥样硬化相关基因t-PA、Pai-1、TF、ET-1和MMP-1、MMP-2及MMP-9在不同时间点的表达变化。
结果显示给予了普通膳食的apoE-/-小鼠尚未形成明显的粥样斑块,但其主动脉内皮下已经形成泡沫细胞；给予西方类型膳的apoE-/-小鼠主动脉有明显的动脉粥样硬化斑块出现,油红O染色显示粥样斑块内存在明显的脂质沉积。
因此,给予普通膳食与西方类型膳的apoE-/-小鼠分别处于动脉粥样硬化的早期与进展期。
Real-time PCR结果显示C57BL/6J小鼠心脏中Pai-1, t-PA,TF 和ET-1的表达高峰出现在ZT14和ZT16之间,表达低谷出现在ZT10；在给予普通膳食的apoE-/-小鼠中三者表达失去了节律；而在给予西方类型膳的apoE-/-小鼠中表达高峰在ZT4,表明三者表达节律出现完全相反的变化。
在C57BL/6J小鼠和apoE-/-小鼠心脏中MMP-1、MMP-2及MMP-9三种基因的表达均未出现明显的节律变化。
综上所述,我们首次发现apoE-/-小鼠发生动脉粥样硬化的过程中,心脏动脉粥样硬化相关基因中某些基因在表达水平与节律发生了改变。
这些改变可能在动脉粥样硬化的病理过程中发挥了重要的作用,对其具体作用以及发生机制仍在进一步研究中。
