实验三 细胞融合
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实验三细胞融合
动物细胞融合是细胞工程技术的重要手段之一，是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。
一、实验目的：
1．掌握PEG体外诱导细胞融合的原理和基本方法。
2．掌握在光学显微镜下融合细胞的形态特征。
二、实验原理
依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为：病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（HVJ）；化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（PEG）；电场诱导的细胞融合。
PEG是乙二醇的多聚化合物，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞融合。
商品PEG存在一系列不同分子质量的多聚体，一般应用PEG4000~6000的溶液，能够产生高频率的细胞融合。
三、实验材料、仪器和试剂
1．材料：成年家鸡。
2．主要仪器：
注射器、刻度离心管、离心机、血细胞计数板、水浴锅、滴管、显微镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、酒精灯等。
3．主要试剂：
1）0.85% NaCl溶液。
2）GKN液：8.0gNaCl，0.4g KCl，1.77g Na2HPO4﹒2H2O，0.69g NaH2PO4﹒H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚红，溶于1000ml重蒸水中。
3）50%（W/V）PEG4000溶液：
a取50g PEG4000放入100mL瓶中，高压灭菌20min；
b让PEG冷却到50~60℃，勿让其凝固；
c加入50mL预热至50 ℃的GKN液，混匀，放入37℃水浴中待用。
4）Hanks原液（10X）：
NaCl 80.0g
Na2HPO4·12H2O 1.2g
KCl 4.0g
KH2PO40.6g
MgSO4·7H2O 2.0g
葡萄糖10.0g
CaCl2 1.4g
称取1.4gCaCl2，溶于30~50ml蒸馏水中，取1000mL的烧杯及容量瓶各1个，先放重蒸水800mL于烧杯中，然后按上页表顺序逐一溶解药品。
直到葡萄糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水定容至1000mL。
5）Hanks液
Hanks原液100mL
重蒸水896mL
0.5%酚红4mL
配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。
6）Janus green 染液。
四、实验方法与步骤
1．鸡血细胞储备液的制备
从家鸡的翼根静脉采血制备抗凝全血（100 IU肝素/5 ml全血）。
在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85 %NaCl溶液，制成红细胞储备液，保存于4℃冰箱，可供一周内使用。
2．鸡血细胞悬液的制备
取鸡血细胞储备液1ml，加入4ml 0.85 %NaCl溶液，混匀后，1200rpm离心5min，弃去上清液，再加入5ml 0.85 %NaCl溶液按上述条件离心一次。
最后，弃去上清液，加入10ml的GKN溶液制成鸡血细胞悬液。
取0.5ml鸡血细胞悬液，用GKN溶液稀释
至1*107个/ml，备用（约相当于取50μl鸡血细胞悬液，加50μlGKN溶液进行稀释）。
3．鸡血细胞的收集
吸取1ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4ml Hanks液混匀，1000rpm离心5min。
弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。
3．PEG诱导细胞融合
吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置2min。
5．终止PEG作用
缓慢加入5ml Hanks液，轻轻吹打混匀，于37℃水浴中静置5min。
6．细胞悬液的制备
用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散，1000rpm离心5min，使细胞完全沉降。
弃去上清液，加Hanks液，再离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀。
7．计算细胞融合率
细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞的细胞核总数之百分比。
融合率=视野内融合细胞的核数/视野内细胞的总核数×100％
8．染色和镜检
吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，加入Janus green染液混匀，染色3min后盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况（注意区分细胞融合与细胞重叠）。
五、注意事项
1. 高Ca2+浓度能够提高细胞融合率。
有些抗凝剂中含有和Ca2+结合的化合物，与血液中的Ca2+形成难解离的可溶性络合物，导致血液中的Ca2+ 浓度降低，故起抗凝血作用，但同时会造成细胞的融合率较低。
2. 必须严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞1～2min。
PEG和二甲基亚砜（DMSO）并用，可以提高细胞的融合率。
3. 融合细胞继续培养就变成一个杂种细胞，它的染色体数不是两核的倍数，因为一些染色体会逐渐消失。
六、作业
1．画出观察到的融合细胞，并计算融合率。
2．说明细胞融合的关键。
