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WB试剂配制

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WB试剂配制 5X电泳液缓冲液 1X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g Tris（MW121.14） 3.02 g 甘氨酸（MW75.07） 94g 甘氨酸（MW75.07） 18.8g SDS 5.00g SDS 1.00g 蒸馏水至 1000ml 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍 10X转膜缓冲液 1X转膜缓冲液 (采用) 甘氨酸（MW75.07） 151.1g 甘氨酸（MW75.07） 2.9 g Tris（MW121.14） 30.3g Tris（MW121.14） 5.8 g 蒸馏水至 1000ml SDS 0.37g 溶解后室温保存,用时稀释10倍， 浓盐酸 1.8 ml 并加入甲醇至20%。 蒸馏水至 800ml 通常取80ml母液，加560ml蒸馏水， 加甲醇200ml定容至1000ml 最加160ml甲醇，配制成800ml即 可。（先加甲醇易产生沉淀） 10XTBS缓冲液 1XTBST缓冲液 Tris（MW121.14） 24.2g 10x TBS缓冲液 100ml NaCl 80.0g 蒸馏水 900ml KCl 2g Tween-20 1 ml 蒸馏水至 1000ml Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取 枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。 （浓HCl调pH至7.6），混匀室温保存。 封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)： 1XTBST缓冲液 95-100 ml 脱脂奶粉 5g 溶解后4℃保存，可于一周内使用。

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Western Blot实验指导教程

Western Blot实验指导教程

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot，WB）

一、 蛋白提取与样本制备

（一）操作步骤

1.提前解冻RIPA（蛋白裂解液），一定要完全融化；

2.根据样本数配制混合溶液：PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）：RIPA=1：100，现用现配）；

3.裂解组织：每个样品称取50mg，加1ml混合液，在冰上用组织剪剪减为碎屑，电动匀浆后4 ℃静置2h使其充分裂解，离心12000g，4 ℃15min，取上清；

4.蛋白定量：

1) 取少量上清稀释10倍：2ul上清，加18ul生理盐水；

2) 标准品按5ug/ul至0.3125ug/ul的梯度进行倍比稀释

（制作平行样的标准曲线：5mg/ml标准品取80ul + 生理盐水80ul）；

3) 配制显色剂BCA混合液：a液：b液=50:1。配制量=200ul*（孔数+6）；

4) 加入稀释完成的各样到酶标板的孔中及BCA混合液200ul/孔；

5) 贴上封口胶，37℃震荡混匀30min；

6) 562nm波长处测吸光度OD；

7) 根据数据制图、添加趋势线、方程及R2。

5.样品OD值带入方程，计算出各样本原液蛋白浓度； 6.样本蛋白浓度均一化（一般样品蛋白浓度为3-4mg/ml）；

7.100℃变性5min。

8.分装并存于-20 ℃，避免反复冻融。

二、 配置相关试剂

（一）10%的SDS（戴口罩称取）：

试剂 剂量

SDS （g） 10

双蒸水（ml） 80

用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，加温溶化后，仍可使用。

（二）1.5M Tris/HCl（pH8.8）

试剂 剂量

Tris base （g） 18.17

双蒸水（ml） 80

用浓盐酸调至pH 8.8，最后定容至100ml。室温下保存。

（三）0.5M Tris/HCl（pH6.8）

试剂 剂量

Tris base （g） 6.06

双蒸水（ml） 80

WB二抗稀释液-凯基生物

WB二抗稀释液-凯基生物

WB二抗稀释液

CatNumber：KGP107ForResearchUseOnlyStoreat4℃foroneyear

Expiredate：20130105

一、试剂盒说明

WB二抗稀释液是蛋白印迹(WesternBlot，WB)等实验中最常用的蛋白类生物试剂，为保证抗体标记物具有较高的

生物活性，厂家在生产运输过程中一般都以较高的浓度分装保存。在蛋白印迹等实验中，为获得较好的染色结果，

降低实验成本，二抗在使用前都需要适当稀释。本产品仅用于WB实验中二抗的稀释。

二、试剂盒组份

WB二抗稀释溶解液100ml

BSA3g

说明书一份

三、使用说明

1、WB二抗稀释液的配制：按照需求的量配制含3％BSA的WB二抗稀释溶解液，比如称取0.3gBSA溶于10ml

的WB二抗稀释溶解液，现配现用。

2、用时取适量用于二抗稀释。二抗的稀释倍数请参照抗体生产厂家使用说明。

四、注意事项

1．本产品属蛋白制剂，室温放置过久易导致蛋白的降解和活性丧失。

2．反复冻融亦会导致蛋白活性的丧失。

3．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4．WB二抗稀释液现配现用。

五、凯基相关产品（详见凯基网站）

1、蛋白提取

核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒

全蛋白提取试剂盒

膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒

线粒体蛋白提取试剂盒

磷酸化蛋白提取试剂盒（简易型）

活性蛋白提取试剂盒

红细胞裂解液

细菌蛋白提取试剂盒

酵母蛋白提取试剂盒

植物蛋白提取试剂盒

蛋白裂解液系列

2、蛋白定量

BCA法蛋白定量检测试剂盒

Bradford

法蛋白定量检测试剂盒

Lowry法蛋白定量检测试剂盒

3、蛋白染色

蛋白质银染检测试剂盒

蛋白质考马斯亮蓝染色检测试剂盒

考马斯亮蓝蛋白快速染液

4、蛋白分子量Marker

蛋白分子量Marker（14KD-116KD）

蛋白分子量Marker（10KD-200KD）

预染蛋白分子量Marker（20KD-118KD）

预染彩色蛋白分子量Marker（11KD-250KD）

WB操作手册(华大蛋白)

WB操作手册(华大蛋白)

WB操作手册： 试剂配制： 10×TBS（储液，可长时间保存） 成分 量 Tris 60.65 gNaCl 730.58 g用三蒸水定容至2500ml 用浓HCl调节PH为7.5 过滤后4℃保存。 1×TBST（短时间储液，可储存一个多月） 成分 量 10×TBS 250.0 ml用三蒸水定容至2500ml 用浓HCl调节PH为7.5 吐温-20 2.0 ml4℃保存。 封闭液（现配） 用TBST配置5%的脱脂奶粉（北京普利莱生物技术有限公司） 一般每张PVDF膜用30ml封闭液。 ECL超敏显色液A，B (普利莱 62053186) PVDF膜 （宽26.5cm 3.75m 孔径：0.45uM immobilon-PSQ） 操作步骤： 1、 跑胶

跑胶：浓缩胶80V，分离胶160V下电泳。溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳，取出

凝胶，做好标记。 2、 处理膜

处理膜：电泳结束前30min左右戴上手套开始准备

1） 裁剪膜：按照膜＝胶

标记（一般为ABCD表示）。

2） 处理PVDF膜：将PVDF膜平铺于100%甲醇液面，靠毛细作用自然浸泡5min以排

除气泡（要在通风厨处理）,再用三蒸水漂洗5min，最后转入1×Transfer buffer

中浸泡20min。若膜沉入甲醇里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸

水。 3） 将滤纸也浸入转移液中浸泡20min。 3、 取胶：撬去玻板，将浓缩胶轻轻刮去，避免把分离胶刮破。将分离胶卸下，左上切

角，用纯水冲洗一下。 4、 转膜

i. 转膜：在转移槽的石墨阳极上滴少许电转液，并按以下顺序放置下物：浸过缓

冲液的滤纸垫（Bio-Rad）、膜、凝胶、浸过缓冲液的滤纸垫，务必使凝胶的

Marker泳道和膜上的标记对应，盖上负极盖。注意要小心无气泡。

ii. 150V转移70-90分钟。

在这时间中要把用了的玻璃板和平皿处理和清洗，并开始配置封闭液。 5、 封闭

WB操作步骤-自己整理

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）

人工肝实验室学习 姚瑶

（一） 目的蛋白提取：

（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。

2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。

共洗三次，每次十分钟。

3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP管内，-20℃裂解30min。

4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做）

5、4℃，12000转离心10min。

6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。

（2）组织中总蛋白的提取：

1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。 2、配平后，4℃，14000转离心10min。

3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用

（二）蛋白含量的测定：

1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。

2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。

3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。

4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。