人工合成靶序列快速构建多靶标RNAi表达载体张秀春;吴坤鑫;赵平娟;刘志昕【摘要】番木瓜环斑病毒(PRSV)正引起番木瓜毁灭性严重病害,番木瓜叶扭曲花叶病毒(PLDMV)也在威胁着目前转基因番木瓜的推广和应用.通过人工合成包含PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列作为模板,扩增两条长短不同但大部分重叠的靶序列,并通过引物设计时添加的特定酶切位点两个靶序列反向连接,形成以长靶序列的5’一部分序列作为发夹结构的环,不需要另外插入内含子序列的反向重复发夹结构的RNAi表达载体pPTN-LS.该方法构建的RNAi表达载体,不仅具有快速、稳定性高等优点,还能同时靶标PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列,能有效提高沉默效率,为利用RNAi技术培育广谱、高效、稳定且安全性高,同时抗PRSV和PLDMV病毒病的转基因番木瓜新种质的奠定基础.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2016(043)007【总页数】6页(P81-86)【关键词】人工合成靶序列;番木瓜环斑病毒;番木瓜叶扭曲花叶病毒;RNAi表达载体【作者】张秀春;吴坤鑫;赵平娟;刘志昕【作者单位】中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101【正文语种】中文【中图分类】S667.9张秀春，吴坤鑫，赵平娟，等. 人工合成靶序列快速构建多靶标RNAi表达载体［J］.广东农业科学，2016，43（7）：81-86.番木瓜（Carica papaya L.）主要分布于热带和亚热带地区，是人们喜爱的果蔬兼药用的热带水果，在我国南方有“万寿果”和“岭南佳果”的美誉。
番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）严重影响着番木瓜产业的健康发展［1］。
随着基因工程抗病分子育种的发展，国内外研究人员先后将PRSV外壳蛋白、复制酶等基因导入番木瓜获得不同的抗PRSV的转基因株系［2-4］。
由于转基因番木瓜对病毒的抗性有株系专化性，但研究结果发现由于各地区PRSV病毒株存在差异，导致一个地区的转基因植物在另一个地区种植表现出的抗病能力减弱，甚至抗性丧失，因而限制了抗PRSV转基因番木瓜的推广和应用。
此外，番木瓜畸形花叶病毒病（Papaya leaf-distortion mosaic virus，PLDMV）是另一种严重危害番木瓜的病原，最早出现在日本，给当地的番木瓜种植业造成很大的损失［5］，20世纪90年代在巴西、台湾等地也有发现［6-7］。
抗PRSV转基因番木瓜品种不具备对PLDMV的抗性，虽然2001年对我国华南地区番木瓜PLDMV发病情况的调查表明尚未发现有相关病例，但2013年杨勇等［8］、张雨良等［9］相继报道在海南发现该病毒，对番木瓜生产构成潜在威胁。
因此，培育稳定、高抗、谱抗且安全性好的新品种对我国番木瓜产业发展具有重要意义。
RNA沉默是利用siRNA指导同源RNA降解或抑制其翻译或修饰同源DNA抑制其转录。
由于不需要产生新的蛋白，因此应用RNA沉默技术在育种中具有高效、特异和安全等特点。
另外，由于反向重复序列片段小，有利于构建含多个病毒基因的嵌合基因，获得同时抗多种病毒的转基因植株。
RNA沉默技术的应用，为我们提供了一条更为有效、安全的抗病毒新策略。
目前利用RNA沉默技术已成功获得高抗、稳定且安全性高的抗病毒转基因大豆、马铃薯、番木瓜等作物［10-11］。
本研究通过比对GenBank中危害番木瓜的两种主要病毒PRSV和PLDMV的多条基因组全长序列，人工合成包含PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列。
以人工合成靶序列为模板，设计扩增长短不同但大部分重叠的两对引物，最后通过引物设计时添加的特定酶切位点使长短不同的两个靶序列反向连接，形成以长靶序列的5’一部分序列作为发夹结构的环，不需要另外插入内含子序列的反向重复发夹结构的RNAi表达载体。
该方法构建RNAi表达载体，不仅具有快速、稳定性高等优点，而且较短的序列就能包含更多的保守序列，具有反向重复发夹结构RNAi载体产生dsRNA的效率更高，并且非反向重复部分的序列也是病毒来源的保守序列，在转基因植物中也能产生dsRNA，因此能有效地提高RNAi载体的抗病毒效率。
本研究构建的RNAi表达载体同时靶标PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列，能有效提高沉默效率，为利用RNAi技术培育广谱、高效、稳定且安全性高、同时抗PRSV 和PLDMV病毒病的转基因番木瓜新种质奠定基础。
1.1 试验材料菌株与质粒：大肠杆菌Escherichia coli DH5α 菌株、克隆载体pRTL-SalI和植物表达载体pPTN200 均由本实验室保存。
酶与试剂：各种限制性内切酶购自Ferments公司，PCR Mix购自TaKaRa公司，克隆载体pMD18、pMD19及质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司。
1.2 试验方法1.2.1 合成序列设计搜索GenBank中PRSV和PLDMV两种病毒的基因组序列，用DNAMAN软件分别进行序列比对后选取PRSV 和PLDMV的Nib和Hc-Pro基因的多个保守区域，总长为621 bp（图 1）。
靶序列由TaKaRa 公司合成。
1.2.2 靶序列克隆根据上述人工合成的靶序列设计两对引物（表1），分别扩增长短不同但大部分序列重叠的两个靶序列，在合成靶序列中的位置如图1所示，引物由TaKaRa 公司合成。
以上述合成靶序列为模板，用LF/LR和SF/SR为引物，进行PCR扩增，获得大小分别为598 bp和530 bp的靶序列L和S。
PCR扩增体系：5 ng/μL合成靶序列1 μL，10 X Pfu Buffer，d NTP Mix 4 μL（2.5 μmol/L），上游和下游引物各1μL，Pfu 0.5 μL，补ddH2O至总体积50 μL。
扩增条件：98℃，30 s；98℃，8 s，65℃，10 s，72℃，30 s，35个循环；72℃，10 min。
PCR产物L和R分别与克隆载体pMD19和 pMD18连接，具体操作方法参照QIAGEN公司连接试剂盒说明书。
连接产物分别转化大肠杆菌Ecoil DH5α，提取质粒，获得pMD19-L和pMD18-S重组子。
用LF/SR为引物进行菌PCR检测，反应体系30 μL，PCR扩增条件：94℃，3 min；94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min，35个循环；72℃，10 min。
PCR检测阳性的pMD19-L重组子进一步用EcoRⅠ/KpnⅠ双酶切和测序鉴定。
PCR检测阳性的pMD18-S重组子用EcoR Ⅰ/NcoⅠ进行双酶切鉴定，由于pMD18-T载体5’端有EcoRⅠ位点而靶序列S正向引物已添加NcoⅠ位点，如果靶序列S是反向插入，则pMD18-S重组子中EcoRⅠ和NcoⅠ分别位于靶序列两侧，EcoRⅠ/NcoⅠ双酶切能切下约500 bp的目的片段；而如果靶序列S是正向插入，则pMD18-S重组子中EcoRⅠ和NcoⅠ位于靶序列同一侧，EcoRⅠ/NcoⅠ双酶切只能将载体线性化。
选取靶序列S为反向插入的pMD18-S重组子进行测序鉴定。
1.2.3 RNAi克隆载体pMD18-LS构建选择靶序列S为反向插入的克隆pMD18-S，并利用pMD18载体上5’端自带的EcoRⅠ和KpnⅠ将pMD18-S质粒DNA线性化。
将EcoRⅠ/KpnⅠ酶切pMD19-L质粒DNA，回收靶序列L并与线性化的pMD18-S连接，使靶序列L定向插入pMD18-S构建成靶序列L和S反向连接的RNAi克隆载体pMD18-LS，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
重组质粒用EcoRⅠ/NcoⅠ进行双酶切鉴定。
1.2.4 RNAi中间表达载体构建 pMD18-LS质粒DNA经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切，切出约1 100 bp靶序列LS，回收目的片段并与EcoRⅠ/SalⅠ双酶切线性化后的中间表达载体pRTL-SalⅠ连接，转化大肠杆菌DH5α，构建RNAi中间表达载体pRTL-LS。
重组质粒用PstⅠ单酶切鉴定。
1.2.5 RNAi表达载体构建PstⅠ单酶切pRTLLS质粒DNA，切出约1 600 bp的片段，回收目的片段，将其插入同样经PstⅠ单酶切的表达载体pPTN200，构建RNAi表达载体pPTN-LS。
转化大肠杆菌DH5α，用LF和SR为引物进行PCR检测后再用PstⅠ单酶切鉴定。
2.1 靶序列设计、合成搜索GenBank中PRSV和PLDMV两种病毒的基因组序列，用DNAMAN软件分别进行序列比后选定两种病毒的Nib和Hc-Pro基因多个共同保守区域，具体序列见表2。
然后按PRSVNib1、PRSV-Nib2、PLDMV-Nib1、PLDMVNib2、PRSV-Hc-Pro、PLDMV-Hc-Pro顺序排列，人工合成总长为621 bp的靶序列。
2.2 靶序列克隆以人工合成靶序列为模板，分别以LF、LR 和SF、SR为引物，用高保真Taq酶进行PCR扩增，得到与靶序列L和S预期大小的目的条带，分别为598、530 bp （图2）；靶序列L和S分别与克隆载体pMD19和pMD18连接后，用LF和SR为引物进行菌落PCR检测，均获得预期大小约为500 bp的目的片段（图3），说明靶序列L和S克隆成功。
由于靶序列L的扩增引物中分别含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位点，重组质粒pMD19-L进一步用EcoRⅠ/KpnⅠ酶切，切下一条大约600 bp预期大小的目的条带（图4），证明pMD19-L克隆成功，测序后通过DNAMAN比对证明目的片段为合成靶序列的部分序列。
由图4可知，3、4号pMD18-S重组子切下一条大约500 bp预期大小的目的片段，说明靶序列S为反向插入；而5、6号pMD18-S重组子只是线性化，说明靶序列S为正向插入。
取靶序列S为反向插入的pMD18-S重组子进行测序，通过DNAMAN比对证明目的片段为合成靶序列的部分序列，并且插入方向为反向。
2.3 RNAi克隆载体pMD18-LS酶切鉴定由于靶序列L和S是反向连接的，并且引物设计时靶序列L的上游引物已添加EcoRⅠ位点，而在靶序列S上游引物添加NcoⅠ位点，因此，用EcoRⅠ /NcoⅠ酶切pMD18-LS重组子，应切下包含靶序列S和L、大小约1 100 bp的片段。
