魔芋低聚甘露糖对小鼠肠绒毛形态和免疫器官指数的影响马艳芳;王晓琴;唐湘华;王功伍【摘要】The purpose of present study is to investigate the effect of Konjac mannose oligosaccharides (KMOS) on intestine villus morphology in normal mice.Fifty adult male KM mice,in five groups (ten animals for each group),were respectively treated (intragastrically infusion) with KMOS at doses of 0 (Control),650,1 400,3 000,or 6 500 mg/kg (dissolved in 0.2 ml saline,once a day) for consecutive 30 d.Thirty days later,all animals were killed and the sections of ileum and cecum were taken out for slicing and staining to measure the diameter and height of the intestine villus.At the same time,the spleen and thymus were weighed for calculation of the organ index.At the end of the drug treatment,the weight of all groups was increased significantly (All P ＜ 0.05),but there was no prominent difference among groups (All P＞0.05).On the intestine villus diameter andheight,there was no significant difference between control animals and KMOS treated animals at most doses (650,1 400,3 000 mg/kg;All P＞0.05).The ileum villus diameter (P ＜ 0.01) and height (P ＜ 0.01) of 6 500 mg/kg KMOS treated animals were significantly higher than that of control animals,and the cecum villus diameter has an increasing tendency (P=0.061).The spleen index of animals from 1 400 ～ 6 500 mg/kg groups were significantly increased compared with control (All P ＜ 0.05).Present results suggested that the KMOS would rise the immunological function of the spleen,and promote the growth of intestine villi,then enlarge thesurface area of intestine absorbing in KM mice.%探讨了魔芋低聚甘露糖(Konjac mannose oligosaccharides,KMOS)对小鼠肠绒毛形态及主要脏器指数的影响.取健康成年雄性昆明种小鼠50只,随机分为5组,每组10只,每天灌胃1次,每次灌胃KMOS生理盐水溶液0.2 mL,剂量分别为0(对照组)、650、1 400、3 000和6 500 mg/kg.连续灌胃30 d后处死小鼠,取其回肠和盲肠段,光镜测量肠绒毛直径和高度,并测定其胸腺和脾脏指数.结果表明,各组动物体重相较给药前均显著提高(P＜0.05),但无明显组间差异(P＞0.05).与对照组相比,650、1 400和3 000 mg/kg组肠绒毛直径和高度无明显改变(P＞0.05),6 500 mg/kg组回肠绒毛直径和高度(P＜0.01)显著增加,盲肠绒毛直径也有增加趋势(P=0.061);同时,1 400、3 000和6 500mg/kg组小鼠的脾脏指数较对照组显著增加(P＜0.05).以上结果说明KMOS可促进小鼠回肠和盲肠绒毛生长,并增强其外周免疫器官功能.【期刊名称】《云南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(038)001【总页数】6页(P40-45)【关键词】低聚甘露糖;回肠;盲肠;肠绒毛;脾脏;昆明小鼠【作者】马艳芳;王晓琴;唐湘华;王功伍【作者单位】云南师范大学生命科学学院行为与认知神经生物学实验室,云南昆明650500;云南师范大学体育学院国家级高原训练实验教学中心,云南昆明650500;云南师范大学生命科学学院行为与认知神经生物学实验室,云南昆明650500;生物能源持续开发利用教育部工程研究中心,云南昆明650500;云南省生物质能与环境生物技术重点实验室,云南昆明650500;云南师范大学生命科学学院行为与认知神经生物学实验室,云南昆明650500;生物能源持续开发利用教育部工程研究中心,云南昆明650500;云南省生物质能与环境生物技术重点实验室,云南昆明650500【正文语种】中文【中图分类】R151.3;TS201.4低聚甘露糖(Mannose Oligosaccharides，MOS)，又名甘露低聚糖、葡甘露低聚糖、甘露寡糖等，主要由2～10个甘露糖和葡萄糖残基以β-或α-糖苷键聚合而成[1].MOS的主要来源是魔芋(Konjac)，魔芋低聚甘露糖(Konjac Mannose Oligosaccharides,KMOS)是由魔芋块茎中含量丰富的甘露聚糖通过物理、化学或酶降解方法得到的一类低聚糖甘露糖[1-3].作为非消化性糖，MOS可直接作用于肠道后段(回肠和大肠)，并可被肠道益生菌所利用，从而发挥广泛的健康促进或益生效应[4].肠道黏膜绒毛能显著增加肠道内表面积，使其可以高效吸收营养物质，因此绒毛的形态指标是肠道吸收功能强弱的重要体现.多项研究指出，MOS作为饲料添加剂，可促进凡纳滨对虾[5]、奥尼罗非鱼[6]、虹鳟[7]、欧洲鲈[8]、半滑舌鳎[9]、肉鸡[10-13]、仔猪[14]及家兔[15]等多种养殖动物的肠道绒毛或微绒毛增高增密，从而增大肠道吸收面积，充分吸收饲料营养，提高养殖生产率.在实验动物研究方面，也有多项研究证明MOS，特别是KMOS，有促进肠道绒毛形态优化的作用.高启禹等报告灌喂0.6 ～1 g/kg的MOS或MOS+活乳酸菌液28 d可使大鼠结肠绒毛增高[16].华朱鸣等报告添加0.5%的MOS饲喂42 d能改善高脂饲料所致的小鼠小肠绒毛缩短、合并乃至脱落的症状[17].冯莉等进一步报道，2～6 g/kg的KMOS灌胃处理10 d可显著降低三硝基苯磺酸所致溃疡性结肠炎小鼠模型的结肠溃疡面积及溃疡率，使其结肠形态有效恢复[18].万嘉佳等则证明以有机溶剂沉淀法制备的低聚合度KMOS(4或8 g/kg)灌胃处理30 d可使小鼠盲肠绒毛增高[4].上述研究提示MOS，特别是KMOS，对肠道绒毛的形态结构(特别是绒毛高度)有很好的保护或促进作用.然而，肠道绒毛表面积参数不仅取决于高度，更与其直径相关.以往研究多关注肠道黏膜绒毛的高度，对绒毛直径参数缺乏关注.本文将以酶解法所得KMOS持续灌胃30 d，观察小鼠回肠和盲肠黏膜绒毛直径、高度等指标的改变情况，并测量其主要免疫器官胸腺和脾脏的指数，为KMOS的食品应用提供理论基础.1 材料与方法1.1 材料KMOS精粉(KMOS含量≥ 95 %)，由本课题组所在生物能源持续开发利用教育部工程研究中心提供技术支持，丽江大然生物有限公司采用酶法生产.所需的试剂有切片石蜡(熔点：50～52 ℃，上海华灵康复器械厂)，无水乙醇(分析纯，天津益仁达化工有限公司)，二甲苯(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染液套装(南昌雨露实验器材有限公司)，戊巴比妥钠(德国默克集团).乙醇、二甲苯和染液主要用于石蜡切片及HE染色过程，戊巴比妥钠用于动物麻醉.实验所用仪器主要有冷冻石蜡两用切片机(KD-202-Ⅵ，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)、恒温鼓风干燥箱(GZX-9023MBE，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)、数码显微镜(BMC500，凤凰光学集团有限公司).50只成年雄性昆明种小鼠，购自成都达硕实验动物有限公司，生产许可证：SCXK(川)2015-030，购入时为6周龄，分笼饲养，每笼10只.动物分为五组，包括一个对照组(每天灌胃一次，每次0.2 ml生理盐水)和四个剂量的给药组(每天灌喂0.2 ml的KMOS生理盐水溶液1次).灌胃前在实验室适应一周，自由饮食，期间每天轻柔抓握、抚摸动物，以降低灌胃引起的应激反应.给药组灌喂KMOS的剂量分别为650 mg/kg、1 400 mg/kg、3 000 mg/kg和6 500 mg/kg.灌胃处理时间共30 d.实验室保持12 h明/12 h暗的周期光照变化，室内温度保持在(22±1)℃.所有实验动物操作均遵照国家《实验动物管理条例》和《云南省实验动物管理条例》进行.1.2 方法1.2.1 脏器指数测定KMOS灌胃30 d后，深度麻醉处死动物(4%戊巴比妥钠，100 mg/kg，腹腔注射)，称重后，立即剖腹，取出2 cm长的回肠和盲肠段，沿肠系膜剪开，用生理盐水冲洗后，将其置于4%甲醛溶液中固定至少7 d.剥离脾脏和胸腺，用滤纸吸去残血后立即称重，并计算脏器指数.脏器指数的计算公式为：脏器指数(%)=脏器湿重/体重×100%.1.2.2 肠道组织学检查剪取充分固定的肠道标本中约5 mm×5 mm的肠道壁，用于常规石蜡切片.切片厚5 μm，每六片取一片，HE染色，中性胶封片，光镜观察并拍照.使用PHMIAS2008图像分析软件(凤凰光学)分别测量回肠绒毛高度和直径及盲肠绒毛的直径，用作统计分析.1.2.3 数据分析动物体重、脏器指数及肠绒毛各参数(高度和直径)数据均用平均值±标准误表示.组间数据使用单因素方差分析(One-way ANOVA analysis)进行比较，并采用Dunnett检验进行Post Hoc多重比较；对组内数据采用重复测量的一般线性模型(General linear model with repeated measurement，GLM-RM) 进行分析，并采用Bonferroni检验进行组内配对比较.统计结果以P < 0.05为统计学差异显著性标准.2 结果图中所有数据均表示为；与对照相比图1 KMOS对小鼠体重的影响Fig.1 Effects of KMOS on the weight of mice 表1 KMOS对小鼠肠道绒毛直径和高度的影响Table 1 Effects of KMOS on the diameter and height of mouse intestine villi剂量/(mg/kg) 回肠绒毛盲肠绒毛直径/μm高度/μm直径/μm0(对照)29.71±1.84119.11±11.5529.34±2.0065030.82±1.47131.97±7.0835.32±1. 78140035.83±1.46125.59±7.4337.32±4.70300034.87±1.17135.24±4.3834.5 0±0.876500 46.57±4.44** 164.54±13.93**42.92±6.70表中所有数据均表示为；与对照相比**P < 0.01.回肠：A 对照；B 650 mg/kg剂量组，C 1 400 mg/kg剂量组，D 3 000 mg/kg 剂量组，E 6 500 mg/kg剂量组.盲肠：F 对照，G 650 mg/kg剂量组，H 1 400 mg/kg剂量组，I 3 000 mg/kg 剂量组，J 6 500 mg/kg剂量组.图中箭头所指即绒毛所在位置.图2 昆明小鼠肠道绒毛显微照片(放大20×)Fig.2 The microphotographs of mouse intestine villi (magni fication 20×)图中所有数据均表示为；与对照相比*P < 0.05，**P < 0.01.图3 KMOS对昆明小鼠脾脏指数(A)和胸腺指数(B)的影响Fig.3 The effects of KMOS on the spleen index(A)and thymus index(B) in KM mice2.1 动物的一般表现和体重改变情况在实验中，灌胃KMOS后，动物粪便颗粒较湿润，提示KMOS具有一定的润肠通便作用.除此之外，动物一般行为与对照组无明显区别.如图1所示，GLM-RM分析表明，动物的体重数据具有显著的时间主效应(F(2.077,89.308)=85.409，P=0.000)，但无明显的时间×药物交互效应(F(8.308,89.308)=1.583，P=0.138)；且组间无统计学差异(F(4,43) = 0.277，P = 0.891).Bonferroni检验表明，灌胃30 d后，各组动物体重较给药前(体重基线)均有明显增长(P<0.05).上述结果提示小鼠体重增长主要受饲养天数(年龄)而非KMOS的影响，随着年龄的增长其体重也随之增加.2.2 KMOS对小鼠回肠绒毛直径和高度的影响如表1和图2A-2E所示，回肠绒毛在直径和高度两方面均存在组间显著差异(单因素方差分析：直径，F(4,45)=7.743 ，P =0.000；高度，F(4,45)=3.381，P=0.017).进一步的多重比较(Dunnett′s test)表明，6 500 mg/kg剂量组小鼠的回肠绒毛高度和直径均大于对照组，存在显著性差异(直径：P=0.000；高度：P=0.006)；其余三给药组与对照组间均无统计学差异(直径：P≥0.229；高度：P≥0.574).以上结果提示，仅有高剂量的KMOS处理(6 500 mg/kg)30 d方可促进回肠绒毛增高、增粗，从而扩大吸收面积，而3 000 mg/kg及以下剂量的KMOS对回肠绒毛直径和高度均无明显影响.2.3 KMOS对盲肠绒毛直径的影响如表1和图2F-J所示，单因素方差分析表明， KMOS各剂量组盲肠绒毛直径和对照组相比，无显著性差异(F(4,41)=1.576，P= 0.199)；多重比较也表明，虽然6 500 mg/kg组小鼠的盲肠绒毛直径较对照组有增加趋势(P = 0.061)，但所有给药组与对照组间的差异均无显著性(P≥0.061).该结果提示，6 500 mg/kg及以下剂量的KMOS处理30 d似乎不能通过促进盲肠绒毛直径增加而影响盲肠吸收面积.2.4 KMOS对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响如图3所示，单因素方差分析表明，胸腺指数未见显著组间差异，但对脾脏指数来说，几乎KMOS各剂量组均显著高于对照组(胸腺，F(4,47)=1.150 ，P=0.346；脾脏，F(4,47)=6.897，P=0.000).组间多重比较也验证了上述方差分析结果(所有P≥0.221)，但3 000 mg/kg组小鼠胸腺指数与对照组相比P=0.221，略有提高的趋势；而对于脾脏指数，1 400、3 000和6 500 mg/kg组均显著高于对照组(650 mg/kg组，P=0.818；1 400 mg/kg组，P=0.001；3 000 mg/kg组，P=0.031；6 500 mg/kg组，P=0.001).3 讨论650 ～ 3 000 mg/kg的KMOS灌胃30 d后，小鼠回肠绒毛的高度与直径，以及盲肠绒毛的直径较对照组均无明显差异.6 500 mg/kg组的回肠绒毛直径与高度均有显著增加，盲肠绒毛直径也有增加趋势.万嘉佳等[4]指出，4 ～ 8 g/kg KMOS处理30 d可使小鼠盲肠绒毛高度增加，而低剂量组无明显作用.高启宇等[16]报告0.6 ～ 1 g/kg KMOS处理28 d可使大鼠结肠绒毛高度增加.本研究所用最高剂量(6 500 mg/kg)介于4 ～ 8 g/kg的有效剂量之间，而盲肠绒毛直径有增加的趋势，但与对照组相比无显著性差异，说明KMOS对小鼠盲肠绒毛形态的影响主要是在增加高度方面，直径方面可能受肠道内部空间解剖结构的限制而增加不明显.华朱鸣等[17]已经证明，添加0.5%的MOS饲喂42 d能改善高脂饲料所致小鼠小肠绒毛缩短、合并乃至脱落的症状，从而使绒毛高度、隐窝深度及绒腺比等参数明显恢复，绒毛形态受损状况减轻.本研究则进一步证明，较高剂量的KMOS不仅可使回肠绒毛高度增加，还可使其直径增大.相对高度指标，直径指标的增加对小肠吸收面积的影响更大，从而可以增强其营养吸收能力.但相较以往研究在养殖动物观察到的MOS增加饲料生产率的作用，本研究并未观察到实验动物体重的显著增长，提示KMOS增加营养吸收能力的同时不会额外起到增重的作用，可降低减肥消费者对该类食品的担忧.虽然KMOS在650～3 000 mg/kg剂量下对肠绒毛长度和高度均无明显影响，但在1 400～6 500 mg/kg剂量范围可以显著增加脾脏指数.胸腺指数和脾脏指数分别体现了中枢免疫器官和外周免疫器官的功能状态.但未观察到显著的胸腺促进效应，提示中枢免疫器官如胸腺受血-胸腺屏障的保护，不易受外界因素的影响.但脾脏属于外周免疫器官，因此可以被KMOS处理所增强.本研究结果与以往报道MOS可增加正常或免疫低下动物的脾脏指数的结果是一致的[19-21].根据万嘉佳等的研究，2～4 g/kg的KMOS可明显促进肠道内产酸拟杆菌的增值[4].该菌能促进B淋巴细胞的增值分化，从而发挥免疫调节作用[22].张力华等报告，0.364～1.092 g/kg KMOS还可以促进乳杆菌和双歧杆菌等正常产酸益生菌群的增殖，并抑制有害菌如大肠杆菌的增殖[23].产酸拟杆菌、乳杆菌和双歧杆菌等益生菌可利用KMOS等低聚糖成分代谢产生丁酸、乳酸等物质，改善肠道环境，促进肠道黏膜的修复，并能促进淋巴细胞的增值[4,22，24].这也许是KMOS可以改善高脂饮食所致的绒毛损伤及三硝基苯磺酸所致溃疡性结肠炎小鼠模型的结肠损伤症状的重要机制之一[17-18].因此，虽然本研究未观察到较低剂量(3 000 mg/kg以下)的KMOS对绒毛形态的改善作用，但其仍可能通过增强肠道有益菌群的增殖和增强免疫器官的功能发挥益生效果.总之，本研究证明KMOS可通过增加小鼠的脾脏指数增强其免疫力，低剂量KMOS对小鼠肠绒毛的形态影响很小，但较高剂量(如6 500 mg/kg)的KMOS除了可以促进小肠绒毛高度增加，还可以促进小肠绒毛直径增加，从而增加小肠吸收面积，促进机体健康.参考文献:【相关文献】[1] 何丹，郭熊，杨双莲，等.酶法制备魔芋甘露寡糖和产物分析[J].中国酿造，2013，32(5):85-88.[2] 骆薇，张迎庆.益生元魔芋葡甘低聚糖研究进展[J].食品与药品，2014，16(4):296-298.[3] 桑鲁燕，周桢，周小华，等.魔芋葡甘聚糖的研究现状[J].食品安全质量检测学报，2016，7(4):1 382-1 386.[4] 万嘉佳，蒋敏，李恒，等.低聚合度魔芋甘露寡糖对正常小鼠肠道及微生物菌群的影响[J].食品与发酵工业，2015，41(9):123-128.[5] ZHANG J，LIU Y，TIAN L，et al.Effects of dietary mannan oligosaccharide on growth performance，gut morphology and stress tolerance of juvenile Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei[J].Fish Shellfish Immunol，2012，33(4):1 027-1 032.[6] 刘爱君，冷向军，李小勤，等.甘露寡糖对奥尼罗非鱼(Oreochromis 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