固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质高慧;邢燕;汪洋;宋金枝;王旭【摘要】建立一种快速、准确测定人体尿液中肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺及5-羟色胺4种单胺类神经递质的方法.尿液样品以Waters Oasis WCX固相萃取柱富集,依次用2 mL 20 mmol/L乙酸铵-甲醇溶液、2 mL甲醇淋洗杂质,最后用5 mL含2%甲酸的乙腈水溶液(85:15,ν:ν)提取被分析物.经Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分离,以甲醇与乙酸钠溶液的不同配比设置流动相梯度,在荧光检测激发波长280 nm,发射波长340 nm条件下,测定人体尿液中4种单胺类神经递质的含量.结果表明:4种单胺类神经递质的回收率为92.2%~104.8%,相对偏差为1.6%~3.1%,检出限为0.002~0.05μg/mL.该方法稳定、快速、简便,能满足人体尿液中多种单胺类神经递质的含量测定.%A rapid and accurate method for detecting pinephrine, norepinephrine, dopamine, serotonin hydrochloridein human urine was developed. The monoamine neurotransmitters were extracted from human urine samples with Waters Oasis WCX solid phase extraction(SPE) cartridges. Then 2 mL 20 mmol/L ammonium acetate-methanol solution, 2 mL methanol were used for eluting impurities. Finally, the analyte were extracted by 5 mL acetonitrile-water solution (85:15,ν:ν) containing 2% formic acid. The separation was performed on Agilent C18 capillary column (250 mm× 4.6 mm, 5μm) followed by different proportion of methanol and sodium acetate solutions gradient elution. Four monoamine neurotransmitters in human urine were detected by high performance liquid chromatography withfluorescence detection (excitation wavelength 280 nm , emission wavelength 340 nm). The results showed the average recoveries were between 92.2% and 104.8%, the relative standard deviations were between 1.6% and 3.1%, and the limits of detection were between 0.002μg/mL and 0.05μg/mL. The method used in this study is stable, fas t and easy. The method has practical value for detecting monoamine neurotransmitters in human urine.【期刊名称】《中国测试》【年(卷),期】2017(043)002【总页数】5页(P60-63,81)【关键词】单胺类神经递质;固相萃取;高效液相色谱;荧光检测【作者】高慧;邢燕;汪洋;宋金枝;王旭【作者单位】淄博市疾病预防控制中心,山东淄博 255026;淄博市疾病预防控制中心,山东淄博 255026;淄博市疾病预防控制中心,山东淄博 255026;杭州医学院,浙江杭州 310053;杭州医学院,浙江杭州 310053【正文语种】中文神经递质是神经末梢分泌的化学物质，在化学突触传递中担当信使的作用。
单胺类物质（MNTs）是最早发现的一类神经递质，包括多巴胺（DA）、肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）和5-羟色胺（5-HT）。
MNTs在中枢神经系统、外周植物神经系统和激素介导的内分泌及外分泌活动中起着极其重要的作用[1]。
固相萃取（solid-phase extraction，SPE）是近年发展起来的一种样品预处理技术，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，与传统的液液萃取法相比较可以提高分析物的回收率，更可将分析物与干扰组分有效分离，正成为复杂样品纯化、富集的有效手段。
人体尿液中单胺类神经递质含量的准确检测，对嗜铬细胞瘤等相关疾病诊断、新药研制开发、药物疗效评价等方面有重要意义。
由于人体尿液基质非常复杂，且单胺类神经递质在尿液中的含量较低，因此对检测方法的灵敏度和选择性都提出较高的要求。
MNTs的检测方法主要有电化学分析法[2]、荧光法[3]、高效液相色谱-荧光检测法[4]、高效液相色谱-电化学检测法[5-6]、毛细管电泳法[7]、色谱-质谱联用法[8-9]。
电化学分析法测定生物样品的稳定性较差，且修饰电极的使用寿命有限，灵敏度不高[2]；荧光法易受样品基质影响，稳定性也较差[3]；毛细管电泳法的重现性较差[7]。
MNTs本身质谱响应信号不强，准确测定存在困难，且色谱-质谱联用法的仪器比较昂贵[8]。
本研究旨在通过固相萃取柱将人体尿液中的单胺类神经递质进行选择性的萃取富集，采用高效液相色谱荧光检测法进行分析，建立一种快速、高效、准确测定尿中4种单胺类神经递质的方法。
1.1 仪器与试剂Waters e2695型高效液相色谱仪-荧光检测器（美国沃特世公司）；Agilent C18色谱柱（250mm× 4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；微量注射器；固相萃取仪（美国色谱科）；CP 225D微量分析天平（德国赛多利斯）；Oasis HLB、Oasis WCX、Oasis WAX固相萃取柱（美国沃特世公司）。
标准品：重酒石酸去甲肾上腺素（美国 Sigma公司），酒石酸肾上腺素（上海阿拉丁试剂有限公司），多巴胺盐酸盐（上海源叶生物科技有限公司），5-羟色胺盐酸盐（上海源叶生物科技有限公司）；甲醇（HPLC级，美国默克公司）；乙腈（HPLC级，美国默克公司）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸铵（分析纯，天津化学试剂有限公司）；乙酸钠（分析纯，上海化学试剂总厂所属上海试剂四厂）；乙二胺四乙酸二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水均为超纯水。
1.2 方法1.2.1 色谱条件反相液相色谱柱Agilent C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；进样量为10 μL；荧光检测激发波长280 nm，发射波长340 nm；柱温为30℃；流动相及梯度洗脱程序如表1所示。
流动相成分中缓冲液即为含0.1mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）的0.04mol/L乙酸钠溶液（pH 4）。
1.2.2 样品的检测1）样品预处理取新鲜人体尿液2mL，加200μL 1mol/L的盐酸溶液将尿液进行酸化处理，随后加入2.0mL 0.5mol/L的乙酸铵，混匀，超声5 min后，以5 000 r/min离心10min。
取上清液，经0.45μm滤膜过滤，滤液于4℃冰箱保存待用。
2）样品制备依次用5 mL甲醇、5 mL水活化Oasis WCX固相萃取柱。
取上述处理过的尿样4 mL上样，流量为1 mL/min，依次用2 mL 20mmol/L乙酸铵-甲醇溶液、2mL甲醇淋洗杂质，最后用5mL含2%甲酸的乙腈水溶液（85∶15，ν∶ν）洗脱被分析物，流量为0.5mL/min。
所得洗脱液氮吹至近干，用初始流动相复溶至1.0mL，经0.22μm滤膜过滤后，供HPLC分析。
1.2.3 标准溶液配制准确称取EP、NE、DA和5-HT标准品各20mg，分别置于10mL容量瓶中，加入0.01mol/L的盐酸溶液，充分震荡使其溶解并定容至刻度，得质量浓度均为2000μg/mL的标准储备液，保存于4℃冰箱中。
1.2.4 标准曲线绘制准确吸取EP、NE、DA和5-HT 4种标准储备液，用0.01mol/L的盐酸溶液稀释为EP 30.0 μg/mL、NE 50.0 μg/mL、DA 50.0 μg/mL和5-HT 20.0 μg/mL的标准应用液。
分别准确吸取标准应用液0.01，0.05，0.30，1.00，2.00mL于10mL容量瓶中，初始流动相定容，用HPLC分析，绘制标准曲线。
1.2.5 测定取1.2.2方法制备的尿液上样，进行HPLC分析，保留时间定性，峰面积定量。
2.1 固相萃取条件的选择及优化2.1.1 固相萃取柱的选择固相萃取的效果取决于其填料类型[10]，本实验分别考察了亲水亲油平衡柱（Oasis HLB）、弱阳离子交换柱（Oasis WCX）和弱阴离子交换柱（Oasis WAX）对神经递质的萃取效果，结果见图1。
表明4种单胺类神经递质在Oasis WCX柱有较好的保留，且回收率最高，杂质去除理想；Oasis HLB回收率次之，但干扰杂质去除不够理想；Oasis WAX回收率不理想。
Oasis WCX柱为弱阳离子交换柱，可吸附带正电的分子。
这4种神经递质极性比较弱，在中性条件下为不带电荷的分子，而在酸性条件下成为带正电荷的弱阳离子。
2.1.2 淋洗液的选择尿样成分复杂，含有多种蛋白质和盐类化合物，会干扰目标化合物的洗脱，因此洗脱之前的净化步骤也很重要。
本文考察了纯水、甲醇、5%氨水-水溶液、20 mmol/L乙酸铵-甲醇溶液4种不同溶剂作为淋洗液的去杂质效果，结果表明，先用2 mL 20mmol/L乙酸铵-甲醇溶液，再用2mL甲醇作为淋洗液时，能最大程度去除尿液中的尿酸及部分中性和碱性化合物的干扰，且对于4种单胺类神经递质在萃取柱有最大保留。
2.1.3 洗脱条件的优化考察了2%甲酸-甲醇、2%甲酸-乙腈、含2%甲酸的乙腈-水（85∶15，ν∶ν）3种不同的洗脱溶液，结果如图2所示。
