最新5核酸印迹与分子杂交

核酸分子杂交的原理和实验方法我跟你说啊，核酸分子杂交这事儿，我一开始也是瞎摸索。

我就知道这是个挺重要的技术，可具体咋回事儿，一头雾水。

先说说原理吧，我觉得可以理解为就是核酸之间的一种特殊的识别和结合。

就好比是一把锁和一把钥匙，只有特定形状的钥匙（互补的核酸序列）才能打开这把锁（与之互补的核酸链）。

核酸无非就是DNA或者RNA 嘛，DNA是双链的结构，像个盘旋的梯子，RNA呢有时候是单链。

在杂交的时候，这个单链的核酸就会去找到另一个双链核酸或者单链核酸当中能跟自己互补的那一部分结合起来。

这个互补就是碱基之间的互补配对，A和T（DNA里）或者A和U（RNA里）配对，G和C配对，我一开始老是记混这配对关系，可吃了不少亏呢。

再说说实验方法。

我试过好多种试剂，有时候都不知道选哪个好。

首先你得准备好样本，样本就是含有核酸的东西，像细胞啥的。

这就像咱做饭前得把食材准备好一样重要。

然后得提取核酸，提取这一步我感觉就像是从一堆杂物里把宝贝挑出来，得小心仔细，不然很容易把核酸弄坏了。

我有一次提取的时候，溶液的浓度没调好，结果核酸都没提出来，白忙乎一场。

提取出来核酸之后呢，就要进行杂交操作了。

你得把要杂交的核酸都放到合适的环境里，这个环境就包括要调好温度、pH值之类的。

温度特别重要，得找到一个最适合的温度，我感觉就像给种子找最适合发芽的温度一样。

如果温度不合适，核酸就不能很好地杂交。

我试了好多回才找到一个差不多的温度范围。

还有杂交之前可能还需要对核酸进行标记，这样方便后面的检测，就像给东西做个标记，以后好找一样。

至于杂交的方式也有好多种，像Southern杂交就是检测DNA的，Northern杂交是检测RNA的。

我感觉理解这些杂交方式就像是分清不同的路线去旅行一样，每个都有它特定的目的地和要求。

比如说Southern 杂交，在操作过程中要注意膜的处理，要确保核酸能很好地附着在膜上，这就像贴贴纸，得让贴纸牢牢地贴在纸上，不能有气泡之类的。

• DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。 •对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、
NL不具备) －－结合能力较NC膜低 －－活化过程较复杂是指将核酸,蛋白质等生物大分 子固定在纤维膜上的过程。将核酸或 蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上 或直接将核酸点到膜上。 （1）物理吸印方法
固相核酸分子杂交类型



Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置
Southern blot
act DNA from cell
2.Cut with restriction enzyme 3.Run on gel(usually agarose)
Northern blot
Extract RNA from cell
Western blot
Extract protein from cell
组织原位杂交
（Tissue in situ hybridization） 组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原 位杂交，它与菌落的原位杂交不同。原位杂交是经适 当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与 DNA或RNA杂交。因此,原位杂交可以确定探针的互补 序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和 病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可 用于显示特定的序列的位置；对分裂期间核DNA的杂 交可研究特定序列在染色质内的功能排布；与细胞 RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中 的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布和动 向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。

加水至 20μl
(2)加入所需的限制酶，并在适当条件下温育
(3)加入适量T4DNA聚合酶。
(4)当切除了所需数量的核苷酸后，加入 1μl2mmol/L四种核苷酸(其中一种为标记核苷酸)，37oC保温一小时。
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标记步骤
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加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)，20mmol/L溶液各1μl。
以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作 加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。
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随机引物标记法特点
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STEP3
STEP2
STEP1
除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是，操作方法同上，但必须采用反转录酶。
标记活性高，只需25ng样品DNA，可在3小时内使40％～60％以上甚至90％的标记dNTP掺入到探针DNA链上
操作方便
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3’末端标记
探针的标记
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随机引物法 标记原理：随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退火，合成标记探针。
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标记步骤
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标记步骤
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取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一毛细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转入上述离心管中
STEP4
STEP3
STEP2
STEP1
影响变性的因素：
影响变性的因素：
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核酸的分子杂交技术及其应用核酸的分子杂交技术及其应用1概述核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。

它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。

在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。

这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。

在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。

作为检测工具用的已知RNA 或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。

它常常用放射性同位素来标记。

虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。

而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。

这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。

2核酸探针的制备核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。

比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。

目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法：2.1DNA的切口平移双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。

这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。

常用于在双链DNA 上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。

由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。