第五章蛋白质和氨基酸的测定
1. 蛋白质概况
蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I 等；
是生物体的重要的结构和功能性物质，也是食品的主要营养物质成分；
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。蛋白质食品是人体对8种必需氨基酸的来源；
蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味；
●
●蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。
●在食品和生物材料中包括蛋白质，还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮的色素），蛋白质测定时需要尽可能加以鉴别；
●由于氨基酸组成不同，不同蛋白质含氮量也不同，一般样品中由于蛋白质种类繁多，使总蛋白含氮量稳定在16％左右，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，6.25为常用的蛋白质系数；
●一些特定种类的样品蛋白质系数为花生5.46，大米5.95，大豆5.71，小麦5.70，牛乳6.38 蛋白质的测定原理分两大类：
●利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；
●利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性、碱性基团及芳香基团等测定蛋白质含量。
凯氏定氮法
●凯氏定氮法是准确性较高的测定方法，常作为标准检验方法；微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器
●凯氏法改良的主要问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及简化操作的问题
●经过不断改进，使应用范围、分析准确度、操作速度方面不断优化
蛋白质快速测定法：
双缩脲法、水杨酸法、考马斯亮兰结合法等显色比色法，
紫外分光光度法，折光法、旋光法等物理分析法
常用于生产中。
氨基酸及测定概况
●氨基酸是蛋白质的水解产物，天然分离的氨基酸达175种以上，但基本氨基酸只有20种，其中Leu,Ile,Lys,Phe,Met,Thr,Ser,Val八种为必需氨基酸，是食品分析中的重要项目
●氨基酸总量——酸碱滴定法，比色法
●各种氨基酸的分离与定量——色谱法
第一节凯氏定氮法测定蛋白总量
●新鲜食品中的含氮化合物以蛋白质为主要成分，样品中还有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉及含氮色素，测出的总氮称为粗蛋白含量
●凯氏定氮法由Kieldahl于1833年提出，经过不断改进，演变为常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法和改良凯氏法等
一、常量凯氏定氮法
1. 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。
通过加碱蒸馏，使氨蒸出，依下法滴定
①用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
②也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。
凯氏定氮法整个过程分三步：
●消化
●蒸馏
●吸收与滴定
1）消化过程及其总反应式：
●2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 =(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
●其中，浓硫酸（98%）具有的脱水性和氧化性，使：
●有机物脱水后炭化为碳、氢、氮。
●碳被氧化为CO2，硫酸被还原为SO2
●SO2使N还原为氨，本身被氧化为SO3
消化过程的促进剂——硫酸钾
●作为增温剂，提高溶液沸点，
●纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。原因在于随着体系体积减小（硫酸分解、水和CO2挥发），使硫酸钾浓度增大，生成的硫酸氢钾增多，使沸点升高，
●也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。
消化过程的催化剂——硫酸铜
加硫酸铜作为催化剂
C+2CuSO4→Cu2SO4↓+ SO2↑+CO2↑
Cu2SO4 +2H2SO4 →2CuSO4 + SO2↑+2H2O
当C被氧化完，Cu2SO4沉淀不再生成，溶液呈现透明的蓝绿色，指示消化终点
还可以做蒸馏时碱性指示剂
其它催化和氧化剂
也可以氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛为催化剂。
加入氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。
2）蒸馏过程
在完全消化的样品溶液中加入过量的浓氢氧化钠，加热蒸馏，使氨全部蒸出，用过量硼酸或标准强酸溶液吸收
3）吸收与滴定
用4%硼酸吸收，用0.1M盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂）
硼酸的K a1＝5.8×10－10，酸性很弱，滴定时不影响指示剂的变色范围
滴定反应的实质是NH3与HCl的强酸弱碱反应，其滴定终点在酸性范围：pH4.3-6.25
用酸滴定
甲基红变色范围pH4.4～6.2 红-黄pKa＝5.2
溴甲酚绿变色范围pH3.8 ～5.4 黄-蓝pKa＝4.9
混合指示剂变色时酸（红-灰-绿）碱变色点pH5.1（ 1 份：5份，0.2％乙醇溶液）
用碱滴定
●用定量过量的H2SO4 或HCl 标准溶液吸收，再用NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，滴定终点pH为4.3～9.7
●以甲基澄（红3.1-4.4黄)、酚酞(无色8.0-9.6红色)或甲基红作指示剂。
2、操作方法：
1) 消化
准确称取固体样品0.2～2g，小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶，加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml，摇匀，安装消化装置，于凯氏瓶口放一个漏斗，将烧瓶斜置于石棉网上；（问题1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么变化？）
常量凯氏定氮消化、蒸馏装置
改进后的消化装置
2）用小火加热，使内容物炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持液体微沸状态，至液体变为蓝绿色澄清，再微沸30分钟；
3）（准备蒸馏）冷却后小心加入200ml蒸馏水，再放冷，加入数个玻璃珠（防止爆沸）。
问题2、消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么？
问题3、瓶颈有什么颜色的有毒烟产生？
问题4、如何判断消化的终点？
4）蒸馏：
●凯氏瓶安装到蒸馏装置中，接受瓶内装入50ml 4％硼酸溶液及混合指示剂2－3滴；从漏斗加入70－80ml40％氢氧化钠溶液，摇动，至溶液变深蓝色或产生黑色沉淀，再加入100ml 蒸馏水，关闭加样口，加热蒸馏，至氨全部蒸出，馏液约250ml。
