实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用

实时荧光PCR技术的应用

医学检验：

基因诊断: 不同的荧光报告基团标记的探针分别与野生型和突变基因杂交，探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种，说明它是一个纯合子，如果荧光信号都增加则表明是一个杂合子。刘敬忠等报道使用dsDNA结合染料SYBR Green I，结合融解曲线分析对α-地中海贫血纯合子、杂合子作出诊断[11]。使用双色荧光标记探针，结合不同的引物设计，可以实现对某些先天性疾病的定量检测。应用实时荧光定量PCR方法对β地中海贫血症(β地贫)患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地贫的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。迄今对遗传性物质改变引起的疾病还无法根治，只能通过产前监测和产前基因诊断，减少病婴出生。因此，实时荧光定量PCR方法可用于产前监测和产前基因诊断。

肿瘤的分子诊断: 肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病,这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病ER基因、肿瘤MDR1基因等，尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一已得到普遍承认。癌因的突变和表达增加,在许多肿瘤早期就出现。实时荧光PCR技术不仅能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。如定量结直肠癌淋巴结的癌胚抗原(CEA)mRNA的表达量，可作为诊断癌症微转移的重要依据。目前，肿瘤患者的生存期已有所延长，但是缓解期的患者仍存在复发的危险，因此，微小残留病变的检测对于进一步调整治疗方案至关重要。实时荧光PCR技术正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备工具。Eckert等提出采用实时荧光PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微残留病灶，对儿童急性白血病的治疗有重要指导意义。

传染病检验：

城乡与环境　

●　—Ｉ：ｈｎｏ　ｌ　ｏｇｖ　Ｖ　Ｉ｝．１　ｎ＿．ｓ　！ｐｎｃ０　ａｌ１ｄ　１、０　Ｒｅ　ｌ　Ｐ　。＇Ｃ）●口■■　

实时荧光定量ＰＣＲ技术在出入境检验　

检疫巾的应用研究进展　

薛银刚陈军宋白薇石建华鞠慧萍郑晨　

（苏州出入境检验检疫局　汀苏　苏州Ｉ　２Ｉ　５１０４）　

中图分类号：Ｒ１１　５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００９　９１４Ｘ（２０１０）０３—０００１一Ｏ１　

１荧光定量ＰＱＲ技术在植物病害早期诊断中的应用　荧光定量ＰＣＲ反应体系最初以ＤＮＡ插入式染料溴化乙锭作为发光物质，　

逐渐发展出更灵敏的ＤＮＡ染料以及荧光探针，根据发光原理主要分为两大　

类：染料法和探针法。荧光定量Ｐ　Ｃ　Ｒ技术以其特异好、灵敏度高、快速　

简便和可定量定性等特点，目前已开始应用于植物病害的检验检疫中。　

１　１植原体导致的植物病害上的应用　

荧光定量ＰＣＲ用于检验检疫已经有段时间，但最近几年才被用于植物病　原菌质体即植物原体的检测。如洋葱黄化病（Ｗｅｉ　ｅｔ　ａ１．，２００４）、菊　

花黄化病植原体（Ｍａｒ　ＺａＣｈｉ　ｅｔ　ａ１．，２００５）和苹果丛生植原体的检测　

（Ｙ０ｒｒｅ　ｓ　ｅｔ　ａ１．，２００５），此外Ａｎｇｅ１ｊ　ｎｉ等人（２００７）利用ＹａｑＭａＩＩ　

探针以及根据植原体ｌ６ｓ核糖体ＲＮＡ设计的引物对葡萄藤黄化病进行检验，　使检测过程相对于传统ＰｃＲ而言缩短了检测时间，增加了方法的特异性和灵　

敏性。因此利用荧光定量ＰＣＲ可以对植原体进行分类鉴定，从而提高出入　

境检验检疫的效率。　

１　２病毒导致的植物病害上的应用　

烟草环斑病毒ＴＲＳＶ是中国公布的二类禁止进境检疫有害生物，它可侵　染５４科３　００多种植物，自然寄主有豆类、花卉、果树和烟草等重要经济　

作物，其传播途径多，危害性大。因此对于ＴＲｓｖ的检验检疫显得尤为重　

要（黄江华等，２　０　０　８）。杨伟东等（２　０　０　６）首次应用免疫捕捉反转录实　时荧光ＰＣＲ技术检测ＴＲＳＶ，由ｊ　综合运用了抗原体特异性结合、核酸分子　

实时荧光定量PCR技术的原理及应用

在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied

Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。

1. 实时荧光定量PCR技术的基本原理

在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数 。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧

第２８卷　第１期　２０１３年１月　内蒙古民族大学学报（自然科学版）　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ　ＶｏＩ．２８　Ｎｏ．１　Ｊａｎ．２０１３　

实时荧光定量ＰＣＲ技术在转基因　

食品检测中的应用研究进展　

倪　娜　，张智勇Ｌ　，李国瑞　，夏春丽　，李　华　，郭　闯　

（１内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽０２８０４３；２．通辽市农业科学研究院，内蒙古通辽０２８０１５）　

［摘要］随着转基因食品的快速发展，转基因食品的大规模商业化引起了对安全性问题的广泛争议．为了对转　

基因食品作出综合的评价，建立灵敏、快速、准确、高通量的检测方法十分必要．本文综述了实时荧光定量ＰＣＲ　

技术的基本原理、优缺点及其在转基因食品检测中的应用与研究进展，并探讨了该技术存在的问题和应用前　

景．　【关键词］转基因食品；实时荧光定量ＰＣＲ；检测方法　

［中图分类号］ＴＳ２　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１６７１—０１８５（２０１３）０１—００６４—０７　

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　

ＰＣＲ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｆｏｏｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　

ＮＩ　Ｎａ　，ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｉ－ｙｏｎｇ　，ＬＩ　Ｇｕｏ—ｒｎｉ　，ＸＩＡ　Ｃｈｕｎ－ｌｉ　，ＬＩ　Ｈｕａ　，ＧＵＯ　Ｃｈｕａｎｇ　

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｔｏｎｇｌｉａｏ　０２８０４３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｏｎｇｌｉａｏ　

Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｎｇｌｉａｏ　０２８０１５，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｆｏｏｄｓ（ＧＭＦ），ａ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｙ　ｗａｓ　ｄｉｓｐｕｔｅｄ