OsRUS2.1酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测潘家强;侯学文【摘要】采用 PCR 技术扩增水稻根UV‐B 敏感基因2.1(ROOT UV‐B S EN S IT IV E 2.1,RUS2.1)四个不同片段[OsRUS2.1(1‐1317),OsRUS2.1(1‐138),OsRUS2.1(139‐879),OsRUS2.1(880‐1317)],连接到 T 载体pMD18‐T‐Simple 上,测序无误后分别亚克隆到猎物表达载体 pGADT7上.结果表明：四个OsRUS2.1基因片段的表达载体构建成功,读码框正确；分别转化这四个猎物表达载体于酵母感受态细胞 Y187中,用 LacZ 、M EL1活性检测法和营养缺陷型培养基SD‐Leu‐DO 培养法进行自激活检测和毒性检测,结果表明构建的四个OsRUS2.1不同片段的猎物表达载体对酵母菌株 Y187均没有转录激活活性和毒害作用,可用于后续研究.%Four fragments of rice(Oryza sativa)ROOT UV‐B SENSIT IV E 2 .1(OsRUS2 .1) ,OsRUS2 .1(1‐1317) , OsRUS2 .1(1‐138) ,OsRUS2 .1 (139‐879) ,OsRUS2 .1 (880‐1317) ,were amplified by PCR from cloned OsRUS2 .1 plasmid ,and were ligated with pMD18‐T‐simple vector ,then transformed to E .coli TOP10 competent cell .The posi‐tive clones were selected and sequenced .The confirmed fragments were subcloned to prey vector pGADT 7 .The four constructed pGADT7 prey vectors were further confirmed by enzyme digestion and sequencing . The confirmed 4 types of pGADT7 prey vectors were transformed to Y187 yeast c ompetent cells .The self‐activation and toxicity of the plasmids to host yeast Y187 were detected by LacZ and MEL1 activity assays and culturing in auxotroph medium SD‐Leu ‐DO .Results showed that the fourconstructed plasmids had no self‐transcriptional a ctivity and not toxicity to yeast strain Y187 ,and they could be used in the following yeast two‐hybrid experiments .【期刊名称】《广西植物》【年(卷),期】2013(000)001【总页数】6页(P76-81)【关键词】水稻根对敏感基因 2.1;猎物载体;酵母双杂交;自激活;毒性检测【作者】潘家强;侯学文【作者单位】华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室，广州 510642;华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室，广州 510642; 华南农业大学生命科学学院植物功能基因组与生物技术重点实验室，广州 510642【正文语种】中文【中图分类】Q782UV-B是太阳辐射的组成部分，它能够穿过大气层到达地表，但到达地表的UV-B 辐照强度与季节、云层厚度以及大气层臭氧含量有关。
近几十年来，随着大气中臭氧含量逐渐下降导致到达地表的UV-B强度有增强的趋势(任健等，2005)。
UV-B 对植物的生理效应根据UV-B辐射强度的不同具有明显的双重效应，即在强度较高时(>1 μmol·m-2·s-1)就作为逆境因子对植物造成伤害；在较低强度下(<1μmol·m-2·s-1)却是一个信号调控因子参与植物的多种光形态建成(Frohnmeyer & Staiger，2003)。
Brown & Jenkins(2008)的研究表明，在拟南芥中存在UVR8依赖和UVR8非依赖的UV-B信号传导途径，近年来对UVR8依赖的UV-B信号传导途径研究取得了很大进展，相继发现这一途径中的几个成员(Brown et al.，2005；Gruber et al.，2010)，特别是确认UVR8就是UV-B受体(Rizzini et al.，2011)及其感受UV-B的机理(Wu et al.，2012)。
UVR8非依赖的UV-B信号传导途径的研究进展较慢，对于这一途径涉及哪些基因，目前尚不清楚。
ROOT UV-B SENSITIVEs(RUSs)是近年来在拟南芥中发现的与极低强度UV-B信号传导有关的基因(Tong et al.，2008)，但它与目前已知的UV-B信号传导途径的关系目前在进一步研究中。
RUS的共同特点是具有一个功能未知的结构域DUF647，采用酵母双杂交技术表明AtRUS1与AtRUS2能通过该结构域互作(Leasure et al.，2009)。
在拟南芥研究的基础上，经生物信息学分析发现水稻基因组中也具有6个OsRUS基因。
我们已用OsRUS1构建了酵母双杂交诱饵载体(潘家强等，2012)，并从水稻cDNA文库中筛选到了一些互作基因，研究结果在进一步分析中。
OsRUS2.1开放阅读框(ORF)全长1 317 bp，结构域DUF647位于138～879 bp，为研究OsRUS2.1是否能与OsRUS1互作以及它们之间通过哪一个结构域互作，我们在已构建好的四个OsRUS1不同片段酵母双杂交诱饵载体的基础上，本文根据OsRUS2.1结构域DUF647的分布情况，构建了四个OsRUS2.1不同片段酵母双杂交猎物载体，并进行毒性及自激活检测，以便用于后续的酵母双杂交技术实验。
酵母(Saccharomyces cererisiae)Y187菌株，pGADT7质粒，阳性对照质粒pGBKT7-53和pGADT7-T，阴性对照质粒pGBKT7-Lam(美国Clontech公司)，大肠杆菌TOP10菌株及已克隆的OsRUS2.1基因pMD18-T-S-BamHI-OsRUS2.1cDNA-1317-HindIII由本实验室保存；YNB和蛋白胨(Difco公司)，SD-Leu-DO(美国Clontech公司)，酵母提取物(OXOID公司)，DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶(TaKaRa公司)，KOD-Plus-Neo DNA聚合酶和dNTPs(TOYOBO公司)，DS2000 Marker(东盛生物公司)，DNA胶回收试剂盒(普博欣生物公司)，2X power Taq PCR Mix(Microanalysis公司)，X-β-gal(BBL 公司)，X-α-gal(GOLDBIO公司)。
本实验所用的引物名称及引物序列：OsRUS2.1 cDNA-EcoRI-1-F：5′-CGAATTCATGAACATACTCGAGAGGATAC-3′；OsRUS2.1 cDNA-BamHI-138-R：5′-AGGATCCTTACAGAGACTCTGCCGGCGT-3′；OsRUS2.1 cDNA-EcoRI-139-F：5′-GGAATTCAAAGTTATCCAAGATTCGAGAC-3′；OsRUS2.1 cDNA-BamHI-879-R：5′-TGGATCCGGAAACCTTTCCACTCTTGAT-3′；OsRUS2.1 cDNA-EcoRI-880-F：5′-GGAATTCAGCCCAGCTGAGCTAAGATATCG-3′；OsRUS2.1 cDNA-BamHI-1317-R：5′-CGGATCCTCATAAAGCACTACCGCTGA-3′；Matchmaker 5′ AD LD-insert screening amplimer：5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′；Matchmaker 3′ AD LD-insert screening amplimer：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′。
以本实验室已克隆并测序的pMD18-T-S-BamHI-1-OsRUS2.1cDNA-1317-HindIII为模板，分别以OsRUS2.1cDNA-EcoRI-1-F/OsRUS2.1 cDNA-BamHI-1317-R，OsRUS2.1cDNA-EcoRI-1-F/OsRUS2.1cDNA-BamHI-138-R，OsRUS2.1 cDNA-EcoRI-139-F/OsRUS2.1cDNA-BamHI-879-R，OsRUS2.1cDNA-EcoRI-880-F/OsRUS2.1cDNA-BamHI-1317-R为引物，采用高保真酶KOD-Plus-Neo DNA聚合酶反应体系，扩增获得OsRUS2.1cDNA 的四个不同片段。
将这四个片段加A后与pMD18-T-Simple连接，转化E.coli TOP10感受态，筛选获得阳性克隆，并经测序确认无突变。
将上述克隆并验证的pMD18-T-S-EcoRI-1-OsRUS2.1cDNA-1317-BamHI、pMD18-T-S-EcoRI-1-OsRUS2.1cDNA-138-BamHI、pMD18-T-S-EcoRI-139-OsRUS2.1cDNA-879-BamHI和pMD18-T-S-EcoRI-880-OsRUS2.1cDNA-1317-BamHI及空载体pGADT7用EcoRI/BamHI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测酶切正确后，按照常规分子生物学连接、转化、筛选，获得pGADT7-EcoRI-1-OsRUS2.1cDNA-1317-BamHI、pGADT7-EcoRI-1-OsRUS2.1cDNA-138-BamHI、pGADT7-EcoRI-139-OsRUS2.1cDNA -879-BamHI和pGADT7-EcoRI-880-OsRUS2.1 cDNA-1317-BamHI 四个重组表达载体，分别采用双酶切鉴定及测序确认读码框正确。
