实验一DNA的小量制备
小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）
1 实验目的：
随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA的性质，掌握分子生物学实验的基本方法。
2 实验原理
细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。
关于植物总DNA的提取主要有两种方法：
1．CTAB 法：
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
2．SDS 法：
利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4
倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管。提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB 法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。
3 材料和试剂：
3.1 青蒿叶片
3.2 试剂
（1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。
表1 CTAB提取缓冲液配制
试剂名称M.W. 配制1000 mL 配制500 mL T ris 121.14 12.114 g 6.057 g EDT A-Na2372.24 7.448 g 3.7224 g NaCl 58.44 81.816 g 40.908 g 用HCl 调pH 值。
（2）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（pH8.0）。
（3）氯仿/异戊醇：将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。
4 仪器设备
离心机、3离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。
5 方法与步骤：
5.1 在提取过程中用到的吸头，提取缓冲液等先高压灭菌（121℃，20min），取出后待用；
5.2 取大约指甲盖大小的植物叶片（约100mg），放入1.5ml的EP管中, 加入液氮，用钢珠研
磨成粉末状；
5.3 预热CTAB缓冲液（含2%的β-巯基乙醇）到65 ℃，加入600μL的CTAB提取缓冲液，混匀；
5.4 EP管内溶液置于65℃水浴45 min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀，颠倒几次，室温静置5min。
5.5 4℃，12,000rpm/min离心10min；
5.6 吸取上清液（约500 μl）于一干净的1.5 ml EP管中，加入1滴3M醋酸钠溶液，加入等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃放置30min沉淀DNA；
5.7 取出，12,000 rpm/min常温离心15min；
5.8 弃上清液，用75%乙醇溶液（900μl）冲洗沉淀两次，
5.9 10,000rpm/min离心1min，倒掉乙醇，再用乙醇同样处理一次，置于干燥仪干燥10min，将水分蒸干；
5.10 加入50μL去离子水，融解DNA，同时加入RNA酶(按每50μL DNA加入1μL RNase)，37℃30min；
5.11 琼脂糖电泳检测DNA：制作1%的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液5μL电泳检测；
5.12 提取的DNA浓度检测：取少量待测DNA样品，用蒸馏水稀释1,000倍；用蒸馏水做空白，利用分光光度计检测OD260分别在260nm、280nm测DNA样品的吸光值；
5.13 -20℃保存DNA备用。
【注意事项】
1. 叶片磨得越细越好。
2. 注意移液器的正确使用。
3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDT A抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。
6. 思考题
1．制备的DNA在什么溶液中较稳定?
2．为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？
