第四章白细胞检验的基本方法
第一节白细胞功能的检验
一、墨汁吞噬试验
【目的】掌握墨汁吞噬试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】墨汁吞噬试验（ink phagocytosis test）是依据血液中的中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用，在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37℃温育4h，涂片染色后，在显微镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数，从而协助急性白血病的诊断与鉴别。
【材料】
1．器材试管、移液管、微量移液器、载玻片、37℃水浴箱、显微镜等。
2．试剂
（1）肝素：配成6U/ml水溶液。
（2）制备墨汁：于普通砚台上加生理盐水5ml，以优质中国块墨或印度墨，以100r/min 研磨3min。所得墨汁经普通滤纸过滤3次备用。
（3）瑞氏染液等。
【方法步骤】
1．取小试管1支，加肝素20μl，加外周血100μl，混匀。
2．加入过滤墨汁10μl，混匀，加塞。
3．置37℃温育4h。
4．取温育后样本，推制成血涂片，干燥后，瑞氏染色。
5．油镜下观察计数幼稚细胞或中性成熟粒细胞100个；计数单核细胞20个。
6．判断结果根据细胞吞噬墨粒多少及大小，可定为下列程度：
阴性：细胞内未见吞噬墨粒。
阳性：(+) 细胞内吞噬有小墨粒1～5个。
(++) 细胞内吞噬有大小不等墨粒10个左右。
(+++) 细胞内吞噬有大墨粒10个左右，小墨粒较多。
(++++) 细胞内吞噬有多数大颗墨粒，并有块状、球状，小墨粒很多，但细胞核清楚。
7．计算吞噬率及吞噬指数
吞噬率（%）= ×100%
吞噬指数=
【注意事项】肝素剂量对白细胞的吞噬功能有影响，肝素用量过大，细胞形态异常，吞噬率和吞噬指数降低；肝素用量过小，影响抗凝。以每100μl血用0.3U肝素为最适宜。【参考范围】
成熟中性粒细胞吞噬率59～89%，吞噬指数66～186；
成熟单核细胞吞噬率90～100%，吞噬指数227～399。
【临床意义】临床上可利用该试验了解吞噬细胞的吞噬功能，对白血病的诊断和分型有一定参考价值。粒细胞仅成熟阶段才具有吞噬功能，单核细胞幼稚阶段和成熟阶段均具有吞噬能力。AML-M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。AML-M2、ALL和AML-M3吞噬试验均为阴性，AML-M4呈阳性反应。CML的成熟粒细胞吞噬能力明显降低。
二、白细胞吞噬功能试验
【目的】掌握白细胞吞噬功能试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】白细胞吞噬功能试验（leukophagocytic function test），是将待测的白细胞与葡萄球菌混合，37℃温育一定时间后，细菌可被中性粒细胞吞噬，涂片染色后，在显微镜下观
察中性粒细胞吞噬细菌的情况，计数吞噬细菌的白细胞数以及被吞噬的细菌总数，计算吞噬率和吞噬指数，据此反映中性粒细胞的吞噬功能。
【材料】
1．器材接种环、小试管、微量细胞培养板、水浴箱、载玻片、显微镜等。
2．试剂
（1）制备菌液：取在琼脂斜面上或平板上培养24h的白色葡萄球菌菌苔，用PBS（0.015mol/L pH6.4）洗2次，沸水浴15～20min灭菌。将灭活菌液混悬于20% FCS-RPMI1640培养液中，用比浊法调整细胞浓度至5×1010/L，置4℃备用。
（2）100U/ml肝素、甲醇、吉姆萨染液等。
【方法步骤】
1．于微量细胞培养板孔内（或小试管内）加100U/ml肝素1滴，无菌采集末梢血3滴，与孔内抗凝剂立即混匀。
2．向孔内（或小试管内）加白色葡萄球菌悬液3滴，混匀。
3．置有盖湿盒内，37℃温育30min，每10min轻摇一次。
4．用滴管取1滴培养液，推成薄片，甲醇固定，吉姆萨染色、干燥。
5．镜检计数油镜下观察计数200个中性粒细胞，记录吞噬细菌的细胞数，以及各个细胞吞噬的细菌总数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。
吞噬率（%）= ×100%
吞噬指数=
【注意事项】
1．所用器材要清洁。
2．抗凝剂用量应适当，过高会抑制吞噬功能，过低则易出现血液凝固。
3．要严格掌握吞噬的时间和条件。细菌与细胞比例以1∶1～10为宜。
4．涂片要薄，以便尽量减少因细菌重叠在细胞上而误以为吞噬的错误。
5．计数时应取载玻片前、中、后三段计数，以提高准确性。
6．本试验采用光学显微镜检查，分辨率不够高，有时难以准确计数吞入的细菌颗粒，应认真识别。
7．应根据各室的具体方法建立本室参考范围，以便客观地判定被测标本中性粒细胞的吞噬能力。
【参考范围】
吞噬率：健康人为61.4～64.2%。
吞噬指数：健康人为1.01～1.11。
【临床意义】白细胞吞噬功能是其最重要的生物功能之一，本试验可作为判断机体白细胞功能状态，诊断白细胞本身所致疾病的参考。
1．吞噬率和吞噬指数增高，反映中性粒细胞吞噬异物功能的增强，常见于细菌性感染。2．吞噬率和吞噬指数降低，见于机体免疫功能低下；营养、代谢、肿瘤等因素致白细胞分化不良或不成熟，如粒细胞性白血病，多发性骨髓瘤等；机体存在明显抑制白细胞的因素，如免疫抑制剂、抗白细胞抗体等。
三、血清溶菌酶活性试验
【目的】掌握血清溶菌酶活性试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】血清溶菌酶活性试验（serum lysozyme activity test），是利用溶菌酶能水解革兰氏阳性球菌细胞壁的乙酰氨基多糖成分，使细胞壁裂解，用对溶菌酶较敏感的微球菌悬液为作用底物，根据微球菌的溶解程度来检测血清或尿中溶菌酶的活性。
（一）平板打孔法
