下载文档原格式
基因工程总结一．概念(1)原理：。
(2)优点：与杂交育种相比，；与诱变育种相比，。
（3）基因工程成功的原因：①成功拼接的原因：②成功表达的原因：二．基本工具1、两种酶：(1)：作用特点：。
(2)：E ·coli DNA 连接酶与T 4 DNA 连接酶的区别：2、一种运载体（1）条件：①；②；③具有特殊的标记基因（作用：）（2）种类：最常用；其他动植物病毒、三、操作程序(1)：方法：①：不知道脱氧核苷酸序列②：已知目的基因两端一小段序列，便于③利用化学方法人工合成：知道全部序列，且基因比较小。
这种方法不需要模板。
(2)——基因工程的核心基因表达载体的组成：(3)生物种类常用方法受体细胞将目的基因插入到Ti 植物动物受精卵将含有目的基因的表＋微生物原核细胞Ca 2处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA 分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 分子质粒的T-DNA 上→农达载体提纯→取卵转化过程杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得色体的DNA 上→表达具有新性状的动物(4)①目的基因是否插入到转基因生物的染色体DNA 上：②是否转录：③是否翻译：④个体水平鉴定：抗虫、抗病接种实验易错点说明：1、切割目的基因和运载体的要求：用限制酶。
目的是：。
同种的含义是：同一种或相同两种，即单酶切或双酶切。
选择双酶切的原因是。
2、工具≠工具酶；运载体≠质粒。
3、启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
启动子：。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
4、基因探针的要求：①单链②有③5、农杆菌转化法中的“2”次导入：第一次：将含有目的基因的T—DNA的质粒导入农杆菌；第二次（非人工操作）：将含有目的基因的T—DNA导入受体细胞并整合到植物细胞的染色体DNA上。
6、转化：。
高考生物《基因工程知识点》总汇1、基因工程的先导是？艾弗里等人的工作证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体2、不同生物的基因为什么可以连接在一起？因为所有生物的DNA基本结构是相同的3、真核生物的基因为什么可以在原核生物体内表达？（或者原核生物的基因为什么可以在真核生物体内表达？）所有生物共用一套密码子4、基因工程育种的原理是什么？具有什么优点？原理：基因重组优点：打破了生殖隔离，定向改造生物的性状5、与DNA有关的酶的比较6、特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割7、限制酶不切割自身DNA的原因是什么？原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
8、DNA连接酶可以连接什么样的末端？①同一种限制酶切割形成的相同的黏性末端②两种不同限制酶切割后形成的相同黏性末端③任意的两个平末端9、如何防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”？可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。
10、载体需具备的条件及其作用11、基因工程的基本操作步骤是哪四步?目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定12、目的基因的获取方法有哪些？三种方法都需要模板吗？①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③通过化学方法人工合成前两种需要模板，从基因文库中寻找目的基因时需要用DNA探针利用DNA分子杂交的方法找到目的基因；化学方法人工合成不需要模板，只要知道核苷酸序列就行，这是一个纯粹的化学反应13、CDNA文库和基因组文库的区别？cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。
以细胞的全部mRNA 逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体成为cDNA文库。
cDNA文库只包含表达的基因，并且逆转录得来的基因缺乏内含子和启动子、终止子等调控序列基因组文库指的是将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆得到的所有重组体内的基因组DNA片段的集合，它包含了该生物的所有基因。
基因工程理论复习整理1、基因工程（gene engineering）的定义：在分子水平上进行遗传操作，即将任何生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或通过人工合成的目的基因，按照人们预先设计的蓝图，插入质粒或病毒复制子（载体），而形成一杂合分子（DNA重组体），然后将重组体转移到复制子所属的宿主生物体中复制，或转移到另一种生物体（受体）的细胞内（可以是原核细胞也可以是真核细胞），使之能在受体细胞内遗传并使受体细胞获得新的性状。
2、基因工程四大要素：目的基因、载体、工具酶、受体细胞。
3、基因工程特点：分子水平操作，细胞水平表达。
4、基因组DNA提取条件（1）提取DNA总的原则：a保证核酸一级结构的完整性；b其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；c核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；d其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
（2）影响因素①减少化学因素对DNA的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH 4-10条件下进行；②减少物理因素对DNA的降解：避免强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中等操作，以避免破坏大分子量的线性DNA分子；③防止核酸的生物降解：避免细胞内、外各种核酸酶对核酸磷酸二酯键的水解作用，DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA 酶的活性。
5、细胞的破碎:一般采用温和处理法裂解细胞。
6、沉淀基因组DNA：加入一定量的预冷的异丙醇或乙醇。
7、质粒可分为紧密控制型和松弛控制型，基因工程中一般用到的是松弛控制型。
8、利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，这种现象称为质粒的不相容性。
9、碱裂解法原理：当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA 在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。
第一章一．名词解释1、基因工程:按工程学原理,将外源基因切割,与载体结合，导入受体细胞,使其稳定表达的过程.2、目的基因：开发人们特殊需要的基因产物或与优良性状相关的基因。
3、工具酶：体外进行DNA合成、切割、连接、修饰等过程需要的酶。
4、DNA药物：在受体细胞内表达产物有药理作用或通过定位整合直接抑制致病基因的DNA。
二．基因工程理论依据（1)基因具有相同的物质基础(2)基因可以切割（3）基因可以转移（4）基因与多肽有对应关系(5）基因的密码是通用的（6）基因可以通过复制遗传给下一代三．基因工程研究内容（1）克隆载体的研究（2)受体的研究（3）工具酶的研究（4）目的基因的研究（5）新技术的研究第二章一．名词解释1、DNA变性：DNA在较高温下，双链间氢键断开，形成单链DNA的过程。
2、DNA复性：变性的DNA，降温时恢复为双链DNA的过程。
3、解链温度:让DNA达到50%变性的温度.4、复制子:从复制起点开始复制出一个DNA分子或片段的核苷酸序列。
5、启动子：不转录RNA，是RNA聚合酶的识别结合位点.6、转录区:能转录相应RNA,包括编码区和终止子。
7、操纵子：原核生物中两个以上基共用一个启动子。
8、内含子:真核生物转录区中的非编码间隔序列.9、限制性核酸内切酶:使一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。
10、稀切酶：有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制性核酸内切酶。
11、同裂酶:不同的酶有相同的识别序列。
12、同尾酶：切割不同识别序列产生相同末端的不同酶。
13、黏性末端：两条链断开位置是交错的，叫黏性末端。
14、平末端：两条链断开位置是平齐的,叫平末端。
15、位点偏爱:某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。
16、酶活单位：限制酶最适条件下60分钟切割1ugDNA所需的酶活性.17、容积活性：1ul酶活单位所具有的酶活性。
第3章基因工程1、什么是基因工程：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程的诞生（三个理论和三个技术）：基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程，具体有三大理论发现和三个技术突破。
1)理论基础：DNA是遗传物质；DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式；2)技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；基因工程载体的构建与应用●理论上的三大发现⑴、发现了遗传物质——DNA1944年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎双球菌转化实验⑵、揭示了遗传物质的分子机制：DNA分子的双螺旋结构和半保留复制1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的DNA双螺旋结构模型、半保留复制图，获1958年诺贝尔奖。
⑶、确立了遗传信息的传递方式：以密码形式传递1963年，美国尼伦伯格（M.W.Nirenberg）和马太（H.Matthaei）确立了遗传信息以密码形式传递，破译了编码氨基酸的遗传密码(3个核苷酸=1个密码子=1个aa)。
●技术上的三大突破⑴、世界上第一个重组DNA实验：实现不同来源DNA的体外重组1972年斯坦福大学化学家伯格（P.Berg）借助内切酶和连接酶将猴病毒SV40的DNA 和大肠杆菌λ噬菌体的DNA在试管中连接在了一起，第一次成功地实现了DNA的体外重组。
⑵、第一个基因克隆实验：重组DNA表达实验，是世界上第一个基因工程实验1973年美国斯坦福大学医学院遗传学家科恩（S.Cohen）将体外构建的含有四环素和卡那霉素抗性基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得了具有双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。
基因工程知识点总结基因工程，这个在现代生物学中熠熠生辉的领域，正以惊人的速度改变着我们的生活和对生命的认知。
它就像是一把神奇的钥匙，开启了无数未知的大门，为解决人类面临的诸多问题带来了前所未有的希望和可能。
一、基因工程的定义与基本原理基因工程，简单来说，就是按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外进行切割、拼接和重组，然后导入另一种生物的细胞内，使之稳定遗传并表达出相应产物的技术。
其基本原理基于三个重要的步骤：首先是获取目的基因，这就像是在茫茫基因海洋中找到我们想要的那一颗珍珠；其次是构建基因表达载体，相当于给这颗珍珠打造一个合适的盒子，使其能够安全、有效地传递；最后是将重组 DNA 分子导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
二、获取目的基因的方法1、从基因文库中获取基因文库就像是一个巨大的基因仓库，里面存储着各种各样的基因。
我们可以根据已知的信息，从这个文库中筛选出我们需要的目的基因。
2、利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 技术就像是一个基因的复印机，能够以极少量的基因片段为模板，快速大量地复制出我们想要的基因。
3、人工合成法如果已知目的基因的核苷酸序列，或者其氨基酸序列，我们可以通过化学方法直接人工合成目的基因。
三、基因表达载体的构建基因表达载体是基因工程的核心部分，它就像是一辆专门运输基因的列车，需要具备多个关键组件。
1、启动子启动子是基因表达的“开关”，它能够控制基因在何时何地开始表达。
2、终止子终止子则是基因表达的“刹车”，告诉基因在何处停止表达。
3、标记基因标记基因就像是一个个小标签，帮助我们筛选出成功导入目的基因的受体细胞。
4、目的基因这是我们最终想要表达的基因片段。
四、将目的基因导入受体细胞1、导入植物细胞（1）农杆菌转化法农杆菌就像是一个天然的基因运输工具，能够将其携带的基因转移到植物细胞中。
（2）基因枪法通过高速的微粒将目的基因直接打入植物细胞。
（3）花粉管通道法利用花粉管通道将目的基因导入植物的受精卵中。
第一章绪论1 •基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA）,转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2•基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现3 •基因工程的基本步骤（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将冃的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞川。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
4 •基因工程的意义（1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。
（2）基因工程在工业中的应用：1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素來生产葡萄糖，发酵成酒。
2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。
或用酿酒酵母生产蛋白质等。
（3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物；用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂-疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。
（4）基因工程在环境保护中的作用：1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌〃分解油（烷怪类）、有机农药污染。
（5）基因工程商业化的发展第二章基因工程主要技术原理1. 质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么质粒的提取和纯化方法最常用的为碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离，复性快。
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起, 在离心的时候沉淀下去。
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
基因工程复习题一、名词解释: （10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交: 将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上, 然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术, 该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。
粘性末端: 双链DNA被限制性内切酶切割后, 形成得两条链错开几个碱基, 而不就是平齐得末端。
Northern印迹杂交: 将RNA进行变性电泳后, 再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术, 可用于检测目得基因得转录水平。
转位: 一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。
基因工程: 在体外, 用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA, 继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞, 最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程, 又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。
目得基因：基因工程中, 那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。
连接器: 人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段, 连接到目得基因得两端, 便于基因重组中得切割与连接。
转化: 受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。
停滞效应: PCR中后期, 随着目得DNA扩展产物逐渐积累, 酶得催化反应趋于饱与, DNA扩增产物得增加减慢, 进入相对稳定状态, 即为停滞效应, 又称平台期。
逆转录PCR: 以mRNA为原始模板进行得PCR反应。
PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板, 引物, 4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下, 特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。
α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中, 插入了lac 启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽）, 该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。
基因⼯程复习重点《基因⼯程》复习重点第⼀章绪论1.克隆：当它作为名词使⽤时，是指从⼀个祖先通过⽆性繁殖⽅式产⽣的后代，或具有相同遗传性状的DNA分⼦、细胞或个体所组成的特殊的⽣命群体；当它作为动词使⽤时，是指从同⼀祖先⽣产这类同⼀的DNA分⼦群或细胞群的过程。
因此，基因⼯程也可称为基因克隆或DNA分⼦克隆。
2.基因⼯程诞⽣于1973年。
3.在现代分⼦⽣物学研究领域中，理论上的三⼤发现及技术上的三⼤发明对基因⼯程的诞⽣起到了决定性的作⽤。
1）理论上的三⼤发现（1）40年代发现了⽣物的遗传物质是DNA⽽不是蛋⽩质。
（2）50年代明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。
（3）60年代确定了遗传信息的传递⽅式，即中⼼法则的建⽴和遗传密码⼦的破译。
2）技术上的三⼤发明（1）利⽤限制酶和连接酶体外切割和连接DNA⽚段。
（2）质粒改造成载体以携带DNA⽚段克隆。
（3）逆转录酶的使⽤打开真核⽣物基因⼯程的⼀条通路。
4.基因⼯程：对不同⽣物的遗传物质--基因，在体外进⾏剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体(质粒、噬菌体、病毒等)转⼊微⽣物、植物或动物细胞内，进⾏⽆性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产⽣出⼈类所需要的产物或组建成新的⽣物类型。
五个⽅⾯的⼯程技术系统（基因、细胞、酶、微⽣物发酵、⽣化⼯程）是相互依赖、相辅相成的，但系统中基因⼯程占主导地位。
5.基因⼯程研究内容包括以下⼏个主要步骤：（1）从现有的⽣物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等⽅法，获得带有⽬的基因的DNA⽚段。
（2）在体外，将带有⽬的基因的外源DNA⽚段连接到具有选择标记的载体分⼦上，形成能够⾃主复制的重组DNA分⼦。
（3）将重组DNA分⼦转移到适宜的受体细胞，并使其⼀起增殖。
（4）从⼤量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分⼦的受体细胞克隆。
（5）由筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的⽬的基因，供进⼀步分析研究使⽤。
第二章基因操作的主要原理1、核酸凝胶电泳的原理及分类？在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态。
将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。
分子量较小的DNA分子，比分子量较大的分子具有更紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
分类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳。
2、影响DNA迁移率的因素有那些？DNA分子量大小；DNA的构象；凝胶的浓度。
3、EB的作用原理。
一种具扁平分子的核酸染料，可插入到DNA或RNA分子的碱基之间。
在300nm紫外灯照射下发射出荧光。
4、核酸分子杂交所依据的原理是什么？有那几种杂交方式？带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
杂交方式有:DNA/DNA印迹杂交——Southern Blotting；RNA/RNA印迹杂交－Northern blotting；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落或噬菌斑杂交。
5、细菌转化的技术方法。
原生质体转化法、化学转化法、电穿孔法。
6、Sanger的双脱氧链终止法的技术路线？利用了DNA聚合酶的两种特性：第一，它能够利用单链的DNA做模板，合成出准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2’,3’-双脱氧核苷酸做底物，使之参入到寡核苷酸连的3’末端，从而终止链的生长。
技术路线：见书7.化学修饰法的技术路线：见P71，参考技术图8.PCR的原理：双链DNA分子在高温下解链成两条单链DNA，然后DNA聚合酶在有一对寡核苷酸引物的存在的情况下，以单链DNA为模板利用反应混合物中的dNTPs合成新生的DNA互补链。
并且，每一条新生链上都具有了新的引物结合位点。
然后反应混合物再经过上述过程，即可有合成新链。
如此反复循环，即可实现特定区段DNA的迅速大量扩增。
9.简并引物：一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。
Taq聚合酶：有5’→3’DNA聚合酶活性；无3’→5’外切酶活性；最适聚合酶温度72℃，连续保温30min具有相当活力，选择72℃延伸；变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性。
Pfu聚合酶：耐热；有5’ 3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性；精确度：pfu >Taq，但pfu扩增效率通常比Taq酶略差反向PCR：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA 片段两侧的未知序列进行扩增。
10.盒式取代诱变的原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒取代野生型基因中的相应序列。
这种寡核苷酸盒是由两条合成的寡核苷酸组成的，当它们退火时，会按设计要求产生出需要的粘性末端。
Kunkel定点诱变：①将待突变的基因克隆入RF-M13 DNA载体上，导入具有dUTP酶（dut-）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung-）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。
② dUTP酶缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。
又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。
由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后进行DNA定点诱变。
③双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。
结果原来的M13模板链被降解，只有突变链因不含U，被保留下来。
这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。
重组PCR定点诱变：详见P9811.凝胶阻滞实验原理：DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质发生结合。
竞争DNA的作用：反应体系中加入超量的非标记竞争DNA，用于研究DNA与蛋白质作用的专一性。
12.DNaseI印迹试验原理：详见P115，参考技术图13.甲基化干扰试验原理：根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理。
第三章1、限制性内切酶识别DNA的特点？什么是同裂酶，什么是同尾酶？Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP 等。
这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大；Ⅱ型酶（狭义的限制性内切酶）：分子量较小（105 Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。
反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个特点，识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。
许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。
（1）基本特点在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。
两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。
（2）识别顺序和酶切位点①识别４-8个相连的核苷酸②对称性③限制酶切后产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH（3）末端种类① 3’-端突起，个数为2或4个核苷酸② 5’-端突起，个数为2或4个核苷酸③平齐末端④非互补的粘性末端，切点在识别顺序之外的Ⅲ型酶：这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24~26bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。
同裂酶：定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶特点：识别相同顺序，切割形成相同的末端同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但产生相同的粘性末端2、说明有哪些因素会影响内切酶活力的？什么是星号活力？1）DNA的纯度:污染的蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制核酸内切酶活力。
（2）DNA的甲基化程：基因克隆中采用失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。
（3）酶切消化的反应温度大多数核酸内切酶的反应温度在37℃，有些酶例外。
（4）DNA的分子结构：DNA分子的不同结构对核酸内切酶的活性有很大影响（5）核酸内切酶的缓冲液（-20℃保存）主要成分：氯化镁、氯化钠、氯化钾，Tris-HCl，β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）Mg2＋：酶发挥活性必需，不正确的Mg2＋和NaCl会影响对特异序列的识别。
Tris-HCl：保证酶反应的pH，一般在pH 7.4条件下功能最佳巯基乙醇：保持某些酶的稳定性；甘油的影响（星号活性）例：EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC，但是如果甘油浓度超过5％（V/V），识别序列发生变化，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割。
3、试举例说明什么是同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法？见书上图。
4、什么是Klenow片段，如何进行DNA末端标记？Klenow片段:由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为76×103dal的大片段分子。
仍具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’的外切酶活性，失去了全酶的5’→3’外切酶活性。
具有3’隐蔽末端的带标记得的DNA片断5’GATCT…3’3’ A…5’在反应物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP，一道温育后生成：5’GATCT…3’3’ *GA…5’ 或是同时加入α-32p-dATP＋ dGTP5’GATCT…3’3’ *AGA…5’5、T4 DNA取代合成法标记DNA的方法⏹在反应过程中，通过T4 DNA聚合作用，反应物中的α-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片段上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。
⏹3’外切酶活力可以切割ds DNA和ss DNA，ds DNA>ss DNA，要控制降解时间。
（图见书上）6、反转录酶的作用方式⏹α链具有聚合酶活性和RNase H活性⏹β链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5’→3’脱氧核酸外切酶活性7、T7 DNA聚合酶的特点⏹1978年，S. Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。
⏹加工形式的T7 DNA聚合酶系：T7噬菌体编码的基因5蛋白质，另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。
⏹基因5蛋白质：具有聚合酶活性和3’→5’外切酶活性；硫氧还蛋白：增强基因5蛋白质与模板引物的结合力⏹具有5’→3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’ →5’核酸外切酶活性。
8、DNA末端转移酶的特点⏹末端脱氧核苷酸转移酶，从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化脱氧核苷三磷酸进行5’→3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。
⏹不需要模板，可以用含有的3’-OH DNA片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。
⏹它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA，也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA，平末端不是有效底物，如果用Co代替Mg做为辅助因子，可以成为有效底物。
9、碱性磷酸酶的作用⏹来自于大肠杆菌或小牛肠，该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸基团，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。
当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。
10、T4多核苷酸激酶特点T4多核苷酸激酶：由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初从T4噬菌体感染的E. coli中分离出来。
⏹作用：催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或者RNA的末端，不受底物分子链的长短限制。
⏹正向反应（forward reaction）碱性磷酸酶处理DNA的5’端使其脱磷酸暴露出5’-OH，多核苷酸激酶将γ-32P-ATP的γ-32P转移到5’-OH，实现末端标记。
11、简述一种核酸内切酶和一种核酸外切酶的作用特点外切酶III（Exo III）——ds DNA1、一般特点：来自于E.coli，分子量28,000 kD2、催化反应类型（1）外切酶活性：3’→5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的ds-DNA，pH 7.6-8.5 , 外切酶活性特点①反应底物：互补ds-DNA ②碱基释放速度：C>>A～T>>G ③反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过渡反应将导致DNA降解（2）核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5 （3）3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4（4）内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5内切酶见第一题。
