下载文档原格式
基因工程总结一．概念(1)原理：。
(2)优点：与杂交育种相比，；与诱变育种相比，。
（3）基因工程成功的原因：①成功拼接的原因：②成功表达的原因：二．基本工具1、两种酶：(1)：作用特点：。
(2)：E ·coli DNA 连接酶与T 4 DNA 连接酶的区别：2、一种运载体（1）条件：①；②；③具有特殊的标记基因（作用：）（2）种类：最常用；其他动植物病毒、三、操作程序(1)：方法：①：不知道脱氧核苷酸序列②：已知目的基因两端一小段序列，便于③利用化学方法人工合成：知道全部序列，且基因比较小。
这种方法不需要模板。
(2)——基因工程的核心基因表达载体的组成：(3)生物种类常用方法受体细胞将目的基因插入到Ti 植物动物受精卵将含有目的基因的表＋微生物原核细胞Ca 2处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA 分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 分子质粒的T-DNA 上→农达载体提纯→取卵转化过程杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得色体的DNA 上→表达具有新性状的动物(4)①目的基因是否插入到转基因生物的染色体DNA 上：②是否转录：③是否翻译：④个体水平鉴定：抗虫、抗病接种实验易错点说明：1、切割目的基因和运载体的要求：用限制酶。
目的是：。
同种的含义是：同一种或相同两种，即单酶切或双酶切。
选择双酶切的原因是。
2、工具≠工具酶；运载体≠质粒。
3、启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
启动子：。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
4、基因探针的要求：①单链②有③5、农杆菌转化法中的“2”次导入：第一次：将含有目的基因的T—DNA的质粒导入农杆菌；第二次（非人工操作）：将含有目的基因的T—DNA导入受体细胞并整合到植物细胞的染色体DNA上。
6、转化：。
第二章分子克隆工具酶基因工程工具酶⏹限制性内切酶——主要用于DNA分子的特异切割⏹DNA甲基化酶——用于DNA分子的甲基化⏹核酸酶——用于DNA和RNA的非特异性切割⏹核酸聚合酶——用于DNA和RNA的合成⏹核酸连接酶——用于DNA和RNA的连接⏹核酸末端修饰酶——用于DNA和RNA的末端修饰⏹其它酶类——用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。
第一节限制性核酸内切酶(restriction enzyme)一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端(3′或5 ′),逐个水解核苷酸。
核酸内切酶：从核酸分子内部切断3′，5′磷酸二酯键。
限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。
1、细菌的限制——修饰现象细菌的限制——修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phageλKR-M 系统的作用:R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。
保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌R-M 系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA 则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。
限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。
由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。
2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶(restriction endonuelease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
一、名词解释1、Gene engineering：(基因工程)是指将一种生物（供体）的基因转移到另一种生物（受体）中去，创建具有某种新性状的生物新品系并能稳定遗传给后代的一种现代生物技术。
2、GMO(Genetically Modified Organism)：(基因工程体)通过基因工程技术创制出的具有某种新性状的生物新品系。
3、DNA denaturation（DNA变性）:DNA变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。
4、exon：（外显子）是DNA 与成熟RNA间的对应区域，是氨基酸的编码区，故又称非隔区。
5、intron:（内含子）是 DNA 与成熟RNA间的非对应区域，是不编码氨基酸的区域，又称间隔区。
6、signal peptide：（信号肽）是指合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移（定位）的N-末端氨基酸序列。
一般由15-30个氨基酸序列组成。
7、ORF（Open reading frame）：（开放阅读框）从mRNA的5’端起始密码子到3’端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为（ORF）。
8、Restriction enzymes：（限制性内切酶）即指识别双链DNA分子中特异位点并水解磷酸二酯键的核酸内切酶。
核酸内切酶就像一把剪刀，可以对DNA分子进行剪切或切割。
9、Vector:（载体）是指在寄主细胞内能自我复制，并能够作为运输载体，将重组DNA分子转移到寄主细胞的DNA分子。
10、genomic library：（基因组文库）将某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体引入受体菌群体中，从而在寄主细胞中保存和扩增。
11、cDNA文库：指某生物某发育时期的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
12、EST（Expressed sequence tag）:(表达序列标签)指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，长度一般为100~500 bp。
一、名词解释1、基因工程工具酶基因工程的操作，是分子水平的操作，它涉及到一系列相互关连的酶促反应，要靠一些重要酶类作工具，对基因进行人工切割和拼接，故称为“工具酶”。
2、限制作用是指宿主细菌可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌。
3、修饰作用而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏4、限制性核酸内切是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶5、3′粘性末端粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构（若是-3），它们能够通过互补碱基间的配对而重新连结起来。
6、平端切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。
7、同裂酶来源不同的限制酶识别序列相同，产生同样的切割，形成同样的末端8、同尾酶来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端10、DNA分子的限制性图谱（限制性酶的识别序列位点）根据用一种或多种限制酶酶切的结果，可以在DNA分子上标识出各种酶切识别序列位点，这种限制性酶切位点的分布图谱11、DNA连接酶能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶12、Taq DNA聚合酶（耐热DNA聚合酶）用于DNA的体外扩增，经25次循环后进入酶的反应稳定期，最适反应温度75摄氏度，对95 摄氏度具有良好稳定性，这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。
13、RNase H （核糖核酸酶H）一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。
RNase H不能水解单链或双链DNA 或RNA中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链DNA或RNA。
14、F因子雄性致育因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。
一、名词1．基因工程：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新生物类型。
2．基因工程工具酶：指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等。
3．基因工程药物：主要指基因工程活性多肽、基因工程疫苗和DNA药物等。
4．Tm：DNA达到50%变性的温度。
5．复性：高温变性的DNA被逐渐冷却时，分开的两条链又会重新结合成双链DNA。
6．杂交：7．复制起始位点：每一种生物DNA的复制总是从特定的位点开始，这个位点具有一定的核苷酸序列，这个序列就叫复制起始位点。
8．复制子：从复制起始位点开始复制出一个DNA分子或一个DNA片段的核苷酸序列称为复制子。
9．启动子：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。
10．SD序列：在原核生物结构基因的起录点下游不远处，总有一个5’-AGGAGG-3’的序列，转录出mRNA上的5’-AGGAGG-3’序列，与核糖体30s亚基16SrRNA3`端的5`-CCUCCU-3`互补，成为30S亚基识别和结合mRNA的位点。
这个序列就叫SD序列。
11．基因编码区：转录mRNA上起始密码AUG至休止密码UAG或UAA、UGA的各种遗传密码的核苷酸序列。
12．转录终止子：在基因编码区下游有一段使转录终止的核苷酸序列。
13．限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每一条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
14．稀切酶：那些长的识别序列和富GC或富AT的识别序列在DNA分子中出现的概率很低，所以把这些识别序列相应的限制性核酸内切酶称稀切酶。
15．同裂酶：有一些限制性核酸内切酶虽然来源不同，但是具有相同的识别序列。
这样的限制性核酸内切酶成为同裂酶。
16．粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称得分布在识别序列中心位置的两侧。
一、填空题1、基因文库的构建通常采用cDNA 法和鸟枪法两种方法。
2 、限制性内切酶识别序列的结构普通为具有 180 度旋转对称的回文结构。
3、DNA 连接酶主要有两种：T4 噬菌体和大肠杆菌 DAN 连接酶。
4、根据质粒在宿主细胞中所含拷贝数的多少，可以把质粒分为两种类型：密切型质粒和松弛型质粒。
5、原核受体细胞通常包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和蓝细菌。
6、原核生物或者低等真核生物，将外源重组 DNA 导入受体细胞的方法有借助生物载体的转化、转染、转导。
7、对细菌细胞进行转化的关键是细胞处于感受态。
8、基因工程是_____1970’____年代发展起来的遗传学的一个分支学科。
9、部份酶切可采取的措施有：(1)减少酶量； (2)缩短反应时间； (3)增大反应体积等。
10、第一个分离的限制性内切核酸酶是EcoK；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是EcoRl。
11、DNA 聚合酶 I 的 Klenow 大片段是用枯草杆菌蛋白酶切割 DNA 聚合酶I 得到的份子量为 76kDa 的大片段，具有两种酶活性：(1)5'-3'合成酶的活性； (2)3'-5'外切核酸酶的活性。
12、为了防止 DNA 的自身环化，可用_碱性磷酸酶__去双链 DNA_ 5’端的磷酸基团_。
13、测序酶是修饰了的 T7 DNA 聚合酶，它惟独5'-3'合成酶的活性，而没有 3'-5' 外切酶的活性。
14、切口移位(nick translation)法标记 DNA 的基本原理在于利用 DNA 聚合酶 I 的5'一 3'合成酶和 5'一 3'合成酶的作用。
15、欲将某一具有突出单链末端的双链 DNA 份子转变成平末端的双链形式，通常可采用S1 核酸酶切割或者DNA 聚合酶补平。
16、反转录酶除了催化 DNA 的合成外，还具有核酸水解酶 H 的作用，可以将DNA-RNA 杂种双链中的 RNA 水解掉。
名词解释1、基因工程：按照人的意愿，由将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下,设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这种的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。
2、基因：是遗传的物质基础，基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
3、基因治疗：是将目的基因放进特定载体中导入靶细胞或组织，通过替换或补偿引起疾病的基因，或者关闭或抑制异常表达的基因来克服疾病的治疗方法。
4、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。
这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。
这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。
5、启动子: 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。
启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。
在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。
有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。
6、基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
7、管家基因：某个基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因。
8、质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。
质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。
质粒有严紧型和松弛型两种类型，在克隆基因中常用的是松弛型，在表达研究中常用的是严紧型。
9、穿梭质粒：既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。
10、质粒的不亲和性（质粒的不相容性）：在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定的共存。
基因工程复习题答案1. 基因工程的定义是什么？基因工程是指通过体外DNA重组和转基因等技术，按照人类的设计，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的技术。
2. 基因工程的基本操作步骤有哪些？基因工程的基本操作步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
3. 基因工程中常用的运载体有哪些？常用的运载体包括质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
4. 基因工程中目的基因的检测方法有哪些？目的基因的检测方法包括分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
分子水平上的检测包括DNA分子杂交技术、分子杂交技术和免疫学方法等；个体水平上的鉴定包括抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
5. 基因工程在农业上的应用有哪些？基因工程在农业上的应用主要包括：提高农作物的抗病虫能力、提高农作物的耐逆境能力、改良农作物的品质、提高农作物的产量等。
6. 基因工程在医学上的应用有哪些？基因工程在医学上的应用主要包括：生产药物、基因治疗、生产疫苗、诊断疾病等。
7. 基因工程的安全性问题主要有哪些？基因工程的安全性问题主要包括：对生物多样性的影响、对生态系统的影响、对人类健康的潜在影响等。
8. 基因工程产品如何进行安全性评价？基因工程产品的安全性评价需要从分子、细胞、个体、种群和生态系统等多个层次进行，包括对基因工程产品的分子特征、生物学特性、生态学特性等方面的评价。
9. 基因工程的伦理问题主要有哪些？基因工程的伦理问题主要包括：对人类尊严的挑战、对生物多样性的影响、对环境的潜在威胁、对人类健康的潜在风险等。
10. 如何平衡基因工程的利弊？平衡基因工程的利弊需要综合考虑其在经济、社会、环境和伦理等方面的影响，通过科学合理的管理和监管，确保基因工程的健康发展。
载体载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制.1、载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件克隆载体:克隆一个基因或DNA片断表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中克隆载体的特点作为基因克隆的载体必须具备以下特性：⑴至少有一个复制起点⑵至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小，拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
β—半乳糖苷酶基因的优点:a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大质粒载体生物学特性：(1)是染色质外的双链共价闭合环形DNA (少数为线形和RNA）(2)能自主复制，是能独立复制的复制子(3)质粒的生存（4）质粒的不相容性（5）质粒的转移（6）携带特殊的遗传标记质粒载体必须具备的基本条件一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件：(i)具有复制起点(ii)具有抗菌素抗生基因（iii）具若干限制酶单一识别位点（iv）具有较小的分子量和较高的拷贝数质粒载体不稳定性的类型结构的不稳定性：主要指由转位和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失。
分离的不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增值成为无质粒的优势群体。
结构的不稳定性DNA的缺失、插入和重排是造成质粒载体结构不稳定性的原因。
1、质粒的自发缺失：同向重复短序列之间的同源重组。
2、寄主染色体及质粒载体上的IS因子或转位因子也会引起结构的不稳定性。
分离的不稳定性细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，寄主细胞分裂时一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖为优势群体。
基因工程课后复习题答案
1. 基因工程的定义是什么？
答案：基因工程是指通过体外DNA重组和转基因等技术，按照人们的意愿，对生物的基因进行改造和重新组合，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2. 基因工程的基本操作步骤包括哪些？
答案：基因工程的基本操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
3. 目的基因的获取方法有哪些？
答案：目的基因的获取方法包括从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、人工合成。
4. 基因表达载体的组成有哪些？
答案：基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点。
5. 基因工程中常用的受体细胞有哪些？
答案：基因工程中常用的受体细胞包括大肠杆菌、酵母菌、动物细胞和植物细胞。
6. 目的基因导入植物细胞的方法有哪些？
答案：目的基因导入植物细胞的方法包括农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。
7. 目的基因导入动物细胞的方法有哪些？
答案：目的基因导入动物细胞的方法包括显微注射法、电穿孔法和脂
质体介导的转化。
8. 目的基因导入微生物细胞的方法有哪些？
答案：目的基因导入微生物细胞的方法包括转化、转导和共轭。
9. 目的基因的检测方法有哪些？
答案：目的基因的检测方法包括DNA分子杂交技术、分子杂交技术和抗原-抗体杂交技术。
10. 基因工程的应用领域有哪些？
答案：基因工程的应用领域包括农业、医学、工业和环保。
大二基因工程复习资料
大二基因工程复习资料
一、基因与基因组
基因是DNA序列，基因组是一个生物所有DNA的总和。
基因的组成成分包括启动子、编码区和终止子。
基因间的间隔区域被称为内含子。
二、DNA复制与转录
DNA复制是利用DNA依靠互补的碱基配对进行的，转录是DNA的基因区被RNA聚合酶复制成RNA。
三、RNA的转录和翻译
RNA复制过程中，DNA的编码区被RNA聚合酶复制成RNA 序列。
RNA的编码区包含起始密码子、编码区和终止密码子，翻译时tRNA将氨基酸对应到特定的密码子上。
四、基因工程技术
基因工程技术是利用生物体内基因的构造和修饰能力，对基因进行进一步的人工干预和调控。
包括基因克隆、转录、转化、瞬时表达等技术。
五、基础实验技能
基础实验技能是基因工程领域必不可少的技术。
包括蛋白质表达、分离纯化、PCR扩增等技术。
六、基因治疗
基因治疗是利用基因工程技术，将正确的基因导入患者体内，用来修复患者缺陷基因的治疗方法。
包括基因替代、基因靶向、基因编辑等方法。
七、生物伦理
在应用基因工程技术的过程中，需要考虑生物伦理问题。
包括个人隐私、安全性问题等。
八、基因工程现状
基因工程技术的应用领域越来越广泛。
包括食品领域、医学领域等。
同时也需要注意其带来的风险和影响。
基因工程总复习题答案1. 基因工程的定义是什么？基因工程是指在体外将目标基因通过人工“剪切”和“拼接”等方法，按照预先设计的蓝图，对生物遗传信息进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物或创造出新的生物类型。
2. 基因工程的基本操作步骤包括哪些？基因工程的基本操作步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞以及目的基因的检测与鉴定。
3. 目的基因的获取方法有哪些？目的基因的获取方法主要有：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、人工合成。
4. 基因表达载体的组成包括哪些部分？基因表达载体的组成包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。
5. 常用的基因工程受体细胞有哪些？常用的基因工程受体细胞有：大肠杆菌、酵母菌、动物细胞和植物细胞。
6. 基因工程在农业上的应用有哪些？基因工程在农业上的应用包括：抗虫转基因植物、抗病转基因植物、耐除草剂转基因植物和抗旱转基因植物等。
7. 基因工程在医学上的应用有哪些？基因工程在医学上的应用包括：基因治疗、生产重组蛋白药物、生产疫苗和基因诊断等。
8. 基因工程可能带来的伦理问题有哪些？基因工程可能带来的伦理问题包括：基因歧视、基因隐私、基因改造生物的安全性和生物多样性的保护等。
9. 基因工程的安全性评价包括哪些方面？基因工程的安全性评价包括：食品安全性评价、环境安全性评价和生态安全性评价。
10. 基因工程的监管措施有哪些？基因工程的监管措施包括：制定相关法律法规、加强伦理审查、建立风险评估体系和实施严格的监管制度。
基因工程复习题答案版
1. 基因工程的定义是什么？
基因工程，又称基因拼接技术或DNA重组技术，是指在体外将不同来
源的DNA分子进行拼接，然后将其导入活细胞中，使其表达出新的遗
传特性。
2. 基因工程的基本操作步骤包括哪些？
基因工程的基本操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
3. 目的基因的获取方法有哪些？
目的基因的获取方法主要有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、
人工合成。
4. 基因表达载体的组成包括哪些部分？
基因表达载体的组成包括启动子、目的基因、终止子、标记基因和复
制原点。
5. 常用的基因表达载体有哪些？
常用的基因表达载体包括原核生物载体、酵母载体、动物病毒载体和
植物病毒载体。
6. 目的基因导入受体细胞的方法有哪些？
目的基因导入受体细胞的方法主要有转化、转染和感染。
7. 目的基因的检测与鉴定方法有哪些？
目的基因的检测与鉴定方法包括分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
8. 基因工程在农业上的应用有哪些？
基因工程在农业上的应用包括抗虫转基因植物、抗病转基因植物、耐除草剂转基因植物、转基因动物和转基因食品。
9. 基因工程在医学上的应用有哪些？
基因工程在医学上的应用包括基因治疗、生产药物、基因诊断和基因疫苗。
10. 基因工程可能带来的伦理问题有哪些？
基因工程可能带来的伦理问题包括对生物多样性的影响、对人类健康的潜在风险、对环境的潜在影响以及对人类社会的伦理挑战。
分子克隆技术期末考试一、名词解释I > Restr i ct i on Endonuc I ease （限制性内切酶）:是一类识别双链DNA分子中的某种特定的核昔酸序列（4-8bp）,并由此处切割DNA的核酸内切酶。
2、Competent ceI I （感受态细胞）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态，即易于吸收外源DNA的细胞。
3、Star activity （星星活性）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
4、Plasmid （质粒）：是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，其大小通常在1-100KB范围内。
5、Plasmid vector （质粒载体）：在由限制性内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导入宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。
6、Binary vector （双元载体）：既有犬肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。
7、shuttle vector （穿梭载体）：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。
例如既能在原核生物中复制，又能在真核生物中复制的载体。
这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列（ARS）以及选择标记性状，具有多克隆位点。
8、I socaudarner （同尾酶）：不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可以产生相同的粘性末端。
同尾酶切割DNA得到的产物可以进行互补连接。
但形成的新位点不能被原来的酶识别。
9、MCS （multiple cloning site,多克隆位点）：是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列，它是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。
10、S igna I peptide （信号肽）：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质定位的N 端的氨基酸序列（有时不一定在N端）II > R/M system （restr ict ion and modif icat ion system,限制与修饰系统）：限制酶和甲基转移酶（甲基化酶）组成限制和修饰系统。
一、绪论1、简述基因工程的概念。答：基因工程是指按照人们的设计，用生物技术直接操作生物的基因组。通过分离和拷贝目的基因或人工合成外源基因，在体外将外源基因插入到载体分子中，成为重组DNA，再导入宿主细胞内，进行扩增和表达。此过程所涉及的方法学称为重组DNA技术，也称分子克隆或基因操作。2、列举基因工程中常用的一些技术。答：（1）基因敲入：以ES细胞培养技术和同源重组为基础，通过转基因将外源基因整合到特定的靶位点，利用靶位点全套的表达调控元件以实现特异性的异位表达。（2）基因敲除：将一个特地设计的DNA片段导入生物体中，通过同源重组使靶基因被置换出而失活的实验技术。（3）基因敲落：是用反义技术，RNAi等降低或抑制靶基因的表达活性。（4）基因打靶：是用同源重组来瞄准希望改变的特定内源基因。（5）基因组编辑：用基因组编辑核酸酶，如锌指核酸酶（ZFN）、归巢核酸内切酶、转录激活子样效应物（TALE）和成簇间隔短回文重复（CRISPR）进行剪切。二、基因工程的分子遗传学基础（一）名词解释1、基因表达：指DNA分子经转录产生互补的RNA分子。2、半保留复制：亲代DNA双链分离后的两条单链均可作为新链合成的模板，复制完成后的子代DNA分子的核苷酸序列均与亲代DNA分子相同，但子代DNA分子的双链一条来自亲代，另一条为新合成的链，故称为半保留复制。3、半不连续复制：是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的，故称为半不连续复制。半不连续模型是DNA复制的基本过程。4、DNA的变性：指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变：溶液粘度降低、溶液旋光性发生改变、增色效应。5、DNA的复性：指变性DNA在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。6、增色效应：指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。7、凝胶电泳：以凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等）为支撑物的区带电泳。用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。（二）问答1、DNA复制过程中有哪些相关酶和蛋白？答：（1）DNA聚合酶：以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA。（2）引物酶：是RNA聚合酶的一种，用来引导RNA引物的合成，从而引导DNA聚合酶介导的DNA链的合成。（3）解螺旋酶：催化双链DNA解螺旋作用。（4）拓扑异构酶：通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数的酶。（5）单链结合蛋白：稳定DNA解开的单链,阻止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。2、简述RNA合成的特点。答：（1）以核酸核苷三磷酸（rNTP）为底物。（2）以DNA为模板。（3）按5’→3’方向合成。（4）无需引物的存在能单独起始链的合成。（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在。（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板。（7）RNA的序列和模板是互补的。3、简述RNA合成和DNA复制的区别。答：（1）转录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链都可作为模板。（2）DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，新链和母链成为子链结合在一起，形成子链。（3）RNA合成不需引物，而DNA复制需引物。（4）转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP。（5）聚合酶系不同。4、简述限制性内切酶的概念，并列举基因工程中常用的几种工具酶。答：限制性内切酶是指识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。常用的工具酶有：限制性内切酶、连接酶、激酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶5、简述Southern和Northernblot，Westernblot的原理。答：（1）DNA印迹（Southernblotting）：用放射性同位素标记的单链DNA探针与尼龙膜上的DNA样本进行分子杂交。（2）RNA印迹（Northernblotting）：将RNA变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，用于与DNA探针杂交以鉴定其中特定RNA分子的大小与含量。不能用碱变性，因为碱会导致RNA的水解。（3）蛋白质印迹（Westernblotting）：经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。6、比较基因（Gene）和开放阅读框（ORF）两个概念内涵的异同答：（1）基因（Gene）：指产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。（2）开放阅读框（ORF）：以起始密码子开始，在三联体读框的倍数后出现终止密码子之间的一段序列。可读框有可能编码出一条多肽链或一种蛋白质。当没有已知蛋白质产物时，该区域被称为可读框，而当确知该可读框编码某一蛋白时，它就被称为编码区，即一个可读框是潜在的编码区。很多情况下，可读框即指某个基因的编码序列。（3）ORF仅仅是基因编码蛋白质的序列,基因应该还包括调控序列和其它非编码区,如调控序列等。
7、论述保证DNA复制精确性的原理
答：（1）复制时以一条链为模板进行半保留复制，且复制时严格按照碱基配对原则。（2）DNA聚合酶具有反向校读机制，在复制中对错配碱基进行校正。（3）DNA聚合酶可以将DNA链弯曲，防止非合成点对合成点的干扰。（4）复制完成后若存在错误，DNA会启动修复机制，包括错配修复(DAM甲基化酶)、切除修复(DNA切割酶)、重组修复(DNA切割酶聚合酶)、DNA直接修复(dna光解酶)、SOS系统等。（三）应用题某DNA的克隆片段用双脱氧法测序。部分的测序电泳胶的放射自显影如图所示：（1）推出由此引物合成的DNA链的序列。标出5’端和3’端答：5’-TTCGAAAGGTGACCCCTGGACCTTTAGA-3’（2）推出用来做为模板链的DNA的序列。标出5’端和3’端答：5’-TCTAAAGGTCCAGGGGTCACCTTTCGAA-3’（3）写出DNA双螺旋的序列。标出5’端和3’端答：5’-TCTAAAGGTCCAGGGGTCACCTTTCGAA-3’3’-AGATTTCCAGGTCCCCAGTGGAAAGCTT-5’（4）简述双脱氧测序法的原理答：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。三、原核生物分子克隆的宿主和载体系统（一）名词解释1、分子克隆：指一个基因被克隆的过程。在基因工程上，分子克隆是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。2、质粒plasmid：指一种在原核生物中常见的能够在染色体外自主复制的DNA分子，附加到细胞中的非细胞染色体或核区DNA，依赖宿主的酶来维持和复制。根据质粒转移的特点，可以分为结合型质粒和非接合型质粒。3、转化：将外源DNA转移到宿主细胞的过程。4、噬菌体：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体，由蛋白质外壳和核酸组成。5、噬菌体展示技术：将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面的技术，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，展示在噬菌体的表面。6、乳糖操纵子：参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。（二）问答题1、分子克隆中的重要工具答：（1）DNA克隆载体，如T载体、pET系列载体等（2）细菌DNA转化方法，如氯化钙诱导、电穿孔等（3）用于DNA复制的特殊大肠杆菌品系，如DH5α、BL21、BIR等3、描述lac操纵子的结构和调控特征答：（1）结构：LacZ（编码β-半乳糖苷酶）、LacY（编码半乳糖苷渗透酶）、LacA（编码半乳糖苷转酰酶）、操纵序列LacO、启动子LacP、编码组合蛋白的基因LacI、CAP或CRP结合位点。（2）调控特征：乳糖操纵子的转录起始受到CAP和阻遏蛋白的双重调控，即正、负调控。①CAP（正调控）：通过结合到启动子上游CAP结合位点，促进RNApol与P的结合，进行有效的转录，产生mRNA，合成更多的β-半乳糖苷酶和透过酶。②阻遏蛋白（负调控）：调节基因I产生的阻遏蛋白结合到操纵基因O上，由于启动子p与操纵基因有一定的重叠，妨碍RNApol与P结合，抑制了结构基因的转录。3、基因工程中常用α-互补来筛选重组质粒，请说明其原理答：许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lacZ′基因。LacZ′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段。宿主和质粒
