基于NMR的代谢组学研究
代谢物是生命过程中发生的生物化学反应的产物，能够从某种程度上反映生命过程的本质。虽然人们对代谢物和代谢水平的认识和研究已经有上百年的历史，但是，将生物体作为一个整体进行研究的代谢组学(metabonomics/metabolomics)，成为分子病理、基因功能分析和系统生物学研究的强有力的技术平台只有7年的历史。1998年Tweeddale等[1]在研究大肠杆菌的代谢时提出了代谢组(Metabolome)这个概念用来表示代谢物整体(total metabolite pool)，并且指出，代谢组分析能够提供有关细胞代谢和调控的信息。Nicholson等[2]在1999 年提出代谢组学的概念(metabonomics)时将其定义为：对病理/生理刺激或基因改变时生物体系的动态代谢响应的多参数定量分析(the quantitative measurement of the dynamic multiparametric metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli or genetic modification)。Metabonomics一词来自希腊文的词根“meta”和“nomos”。“meta”意思是“变化(change)”，“nomos”意思是“规律”或“原则”(就象economics)。从这个定义本身不难看出，代谢组学分析的对象是生物体本身，而且是一个动态的整体。Nicholson研究组的工作包括动物体生理[3~5]、药物毒理[6~9]、分子表型学[10,11]、疾病诊断[12~14]和以系统生物学为基础的功能基因组学[15~17]。Fiehn等[18]在2000年，Raamsdonk 等[19]在2001 年又提出了metabolomics
这个单词，用以强调把代谢组学这个技术平台用于研究细胞系统基因的功能。目前，metabolomics有多个定义，但其本质是：给定细胞在给定时间和环境下的所有小分子代谢物的定量分析(the quantitative measurement of all low molecular weight metabolites in an organism's cells at a specified time under specific environmental conditions)。所以从定义来看，metabolomics指的是静态生物体系代谢组分析，因此可以认为是metabonomics 的一部分。事实上，近年来也有动态代谢组学(dynamic metabolomics)[20]提法出现，说明metabolomics的含义正在
朝着metabonomics靠近。在中文的表述中，没有必要将两个名词分开,一律用“代谢组学”以避免不必要的名词混淆。2002年以来，Nicholson等[21]和Fiehn等[22]
分别撰写综述文章从不同的角度阐明代谢组学是研究药物毒性和基因功能的平台技术，以及联结基因型和性状表型的有力工具。这一系列论述奠定了代谢组学的基础。代谢组学的出现，主要得益于分析技术的发展使得对大量样品和大量代谢物的快速定量测定成为可能，而最为常用的方法是核磁共振(NMR) 和质谱(MS)(图1) 。
1 代谢组学的发展趋势
代谢组学是一个全新的研究热点。这主要表现在：第一、代谢组学的研究论文数正在以指数方式增长(图1)；第二、高影响因子(>8.0) 学术刊物上发表的论文数量较多(>60 篇)[17~19,21,23~81]；第三、核心论文引用率高，其中引用100 次以上的有6篇，单篇最高引用接近240 次；第四、研究范围广泛并不断增加，涉及到功能基因组学、营养学、病理学、药理学、毒理学、植物学、微生物学以及系统生物学等众多领域；第五、仪器和分析技术的快速发展为代谢组学的进步提供了更加广阔的空间，也就带来了更多的挑战和机会。不断提高的磁场强度使得核磁共振谱仪的分辨率有了更进一步的提升，超低温探头的出现也让NMR的检测灵敏度有了一定程度的提高。自动进样技术极大的缩短了大批量样品的检测时间。而计算机技术的飞速发展为数据分析的速度和可靠性提供了更有力的支撑。
2 代谢组学与基因组学、蛋白质组学的关系
代谢组学研究的是在病理生理刺激或基因改变条件下生物体系代谢水平的应答，此前提出的基因组学和蛋白质组学则分别从基因水平和细胞蛋白表达水平研究生物体系对药物刺激的响应。每个物种的基因组所含的基因序列与基因数目相对固定，但这些基因的表达水平会随着发育阶段不同或外部条件的变化而变化。从药物研究和毒理学的角度来看，基因组学研究的是生物体受外源性药物刺激后基因表达的改变，然而基因表达的改变或者调节与细胞系统整体功能之间的关系尚不清楚。因此蛋白质组学方法主要针对给药或其它病理生理过程引起的细胞蛋白质组成的变化进行半定量测量[82~84]。尽管与基因组学相比，蛋白质组学研究不那么昂贵，但是由于蛋白质数量众多，现有蛋白组学手段通量有限，因此劳动强度较大，进展缓慢。同时必须指出，基因组、转录组和蛋白质组研究更强调生命过程的调控机制和物质基础，而代谢组是以体内生物化学反应的产物的整体变化为出发点来研究生命过程的本质。事实上，多数哺乳动物(如人)是动物体本身(宿主)和消化系统微生物菌群共同进化、协同工作的“协同生物体”(symbiotic species)[85]，对宿主本身的基因，
蛋白质的认识只是该体系的一小部分[86]。因此，基因组、转录组、蛋白质组和代谢组是从不同层面和水平上研究生命过程的途径。
基因和蛋白质数量众多，它们的功能除了与一级和二级结构有关外，在更多情况下与它们的三级结构、动力学过程和相互作用有关。这也是功能基因组学和功能蛋白质组学研究的重点。与此形成对比的是，代谢物分型要少得多。目前已知的代谢物只有几千种。由于代谢物是生命过程的终端产物，不仅分子量小而且在所有的生物体中都是相同的，因此，一般不存在三维结构和动力学的问题，也不要求完整的基因序列或者庞大的EST(Expression Sequence Tag)数据库。基因和蛋白表达具有重复性，由此导致的代谢物或代谢水平的变化则具有累加性。这种含量上的放大效应，使得代谢物的识别比基因或蛋白质的识别要容易得多。有限的代谢物分型必然导致一种代谢物同时涉及多个代谢过程或代谢循环。每个代谢循环会产生多个代谢物，不同代谢循环之间相互联系、互相影响。代谢组学正是从代谢物整体变化的角度来研究生物体对各种刺激的动态响应。
3 代谢组学研究方法
体液中的代谢物质与细胞以及组织中的代谢物质处在一个动态的平衡当中，所以当机体由于毒性或代谢障碍导致组织细胞出现异常的时候，生物体液的组成就会产生变化。代谢组学研究方法就是检测代谢物水平的整体和动态变化，提取潜在的有诊断或常规程序化价值的生化信息，以此来反映生物体在外源刺激作用下真实的体内的生物学过程，建立“组学”参数的输入与响应输出之间的联系。
代谢物整体水平的检测所依赖的方法是分析化学中的各种谱学技术，如核磁共振波谱、质谱、高效液相色谱、红外光谱、紫外可见光谱以及各种原子光谱等。对海量谱学数据进行统计和归类分析，从中提取代谢特征或代谢时空的整体变化规律，是分析化学中的化学计量学或化学信息学的研究范畴。值得指出的是，代谢组学所强调的代谢特征或代谢时空的整体变化，不是传统意义上的某种代谢物或少数几种代谢物含量和存在方式的变化。建立代谢特征或代谢时空的变化与生物体特性的变化之间的有机联系，是代谢组学研究的最终目标。因此，分析化学在代谢组学研究中发挥着非常重要的作用，甚至是不可取代的作用。
3.1 代谢组学的研究过程
代谢组学研究一般包括四个步骤：第一步，给予生物体一定的刺激。这种刺激可以是基因的变异、剔除或引入，体内生物过程的催化或抑制，致病或致病物质(无机、有机、病毒、细菌、寄生虫等等)的引入，以及各种环境因素的改变等等。除了刺激因素之外，引入刺激的时间和强度等也需要精心设计。适合于代谢组学研究的样品种类非常广泛，可以说是无所不包，例如尿液、血液、组织或组织提取物、器官甚至整个生物体等等。样品收集时间、部位、种类等应给予充分考虑。第二步，代谢组数据的采集。用核磁共振、质谱、色谱等分析手段测定其中代谢物的种类、含量和状态以及其变化。第三步，建立表征代谢特征的时空模型[87]。在代谢组学中最常用的建模方法是主成分分析(Principle Components Analysis, PCA)。PCA 是对多变量数据进行统计处理的一种数据线性投影方法，它在保留原有信息的基础上将高
维空间中的样本投影到较低维的主成分空间中。其基本思路是以一种最优化方法浓缩数据，寻找几个由原始变量线性组合而成的主成分,以揭示原始数据的特征，提取基本信息，实现对数据的可视化和样本的分类聚集。用PCA 方法建立的以代谢物的种类、含量和状态随时间的变化为基础的代谢物时空模型应能够清楚地反映出外源性刺激的种类、程度和动态变化以及引起样本在时空模型中的不同分布的标志性代谢物。第四步，建立代谢物时空变化与生物体特性的关系，达到从不同层次和水平上阐述生物体对相应刺激的响应的目的。
3.2 基于NMR的代谢组学的特点
作为众多化学分析方法中的一种，NMR在代谢物组学的研究中起着非常重要的作用。这主要取决于NMR所具有的优势：首先，用NMR分析生物体液等复杂混合物时样品的前处理简单，测试手段丰富，包括液体高分辨NMR、高分辨魔角旋转
(HR-MAS)NMR 和活体核磁共振波谱(MRS)，因此，能够在最接近生理状态的条件下对不同类型的样品进行检测。其中需要特别提到HR-MAS方法，该方法是将样品在与静磁场成魔角(54.7°) 的方向旋转，消除了磁场不均匀性、化学位移各向异性和偶极－偶极相互作用带来的谱线增宽影响，从而可以获得与液体高分辨NMR相媲美的分辨率。更重要是，这种方法对代谢物在组织中的定位有独特的优点，目前已经有不少将此方法用于肝脏[88~90]，脑组织[91~93]，前列腺[94~96]等组织的研究报道。其次，NMR 是一种无损的多参数和动态分析技术，NMR同时具有定性分析和定量分析功能，并且通过单次检测可以得到所有含量在NMR检测限以上的物质(含有NMR可观测核的物质)的特征NMR谱，以及这些物质在整个刺激周期中的动态变化，而且NMR谱携带有丰富的分子结构和动力学信息；再次，NMR检测可以在很短的时间内完成(一般5～10 min)，这对于实现高通量样品检测和保证样品在检测期内维持原有性质来说是至关重要的。此外，流动探头、自动进样技术和自动NMR谱处理技术的出现和不断完善，也使得测定速度和准确性不断提高。而且，核磁共振手段灵活多变，通过操控脉冲序列我们可以获得多种多样的信息。例如代谢组学中常用到的谱编辑手段[88,97~99]：使用单脉冲、CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)和扩散加权序列，可以分别获得样品中不同官能团、不同分子量或不同存在状态的分子的1H NMR谱。
当然NMR方法也有其局限性，例如它的检测灵敏度较低，而且检测动态范围有限，很难同时检测同一样品中含量相差很大的物质。色谱(LC)以其卓越的分离能力，质谱(MS)技术以其普适性、高灵敏度和专一性，也成为代谢组学中重要的分析手段，但是它们也存在各自的缺陷，如色谱和质谱的选择性检测能力较差、大量谱峰的识别以及方法的重现性问题、质谱中不同离子化程度对代谢物定量的影响等。
4 代谢组学研究的广泛应用
代谢组学经过几年的发展，方法正日趋成熟，其应用已经渗入生命科学研究的方方面面，并日益彰显出其强有力的科学潜能。
4.1 药物开发、安全性评价
快速发展的医药工业对分析手段的效率以及可靠性提出了更高的要求。药物直接或者通过某些代谢途径产生的代谢物使基因表达产生改变，基因表达的改变又会影
响蛋白质的合成，基因与蛋白质的变化都可以造成毒理终点的产生；另外药物通过代谢进入血液，进而分布到一些组织器官产生作用，也能形成毒理终点。而毒理终点造成的生化改变是NMR所能检测到的。对NMR数据采用适当的化学计量学和多
变量分析方法，就能提取出丰富的药物代谢信息。因此代谢组学在制药工业中发挥着巨大的作用：在药物开发阶段，代谢组学不仅可以进行早期活体毒理测试，而且能为药物分子的筛选提供依据；在药物临床应用前，它能帮助确定药物的安全性生物标记物和代谢表型，并能评价将动物模型实验应用于人类疾病的可行性。
Nicholson研究组多年的实验发现：基于NMR的代谢组学方法不仅能区分组织器官的正常与非正常的状态，而且能给出毒性作用的靶器官以及作用机制，识别出毒性的生物标记物。他们的工作主要集中在药物对肾脏、肝脏毒性的研究上，通过长期的实验经验积累，他们将体液的磁共振波谱分解成一系列的“生物标记物窗口”，这些“窗口”分别与特定的器官毒性相对应，从而可以从简单的1D1H NMR谱获取丰富的毒理信息[21]。在药物毒理代谢组学的研究领域，最为瞩目的工作是国际
COMET(Consortium for Metabonomic Toxicology)计划[100,101]，该计划由五家著名的制药公司与英国帝国理工学院联合完成，旨在用啮齿动物的尿液、血液的1H NMR
谱建立代谢组数据库，并为目标器官及其位点的毒性建立预测性专家系统。在完成约147种毒性模型的实验研究后，他们已经建立起了第一个基于机器学习的实验室啮齿动物肝脏和肾脏毒性预测的专家系统。
4.2 病理学研究
由于病理状态造成的代谢紊乱同样也是核磁共振技术所能检测的，同时，机体任何部分出现异常状态，在体液的组成上都会有反映。
相对于传统的医疗诊断方法，代谢组学方法具有无创性及样品制备简单等优点，因此其应用范围涵盖了先天性代谢缺陷、肾脏和肝脏移植、Alzheimer疾病、癌症等广泛的领域[102~104]。其中典型的例子是冠心病的研究。冠心病以前主要通过血管造影术来诊断，该方法不仅昂贵，而且伴随有不良反应，甚至可能导致死亡。而Brindle 等[25]用代谢组学方法用于冠心病诊断，结果显示经过正交信号校正(OSC) 的模式识别方法能很好的区分重症冠心病(三支血管疾病，TVD)和冠状动脉正常人的血清。另外，对于传统的测量血压、总胆固醇、总甘油三脂、纤维蛋白素原、白细胞数量等冠心病危险度因子(risk factor)无法区分的不同严重程度的冠心病，代谢组学方法也能很好的区分，并且通过回归分析，发现VLDL、LDL、HDL和胆碱等是导致两者区分的主要因素。他们也用代谢组学方法对不同程度的高血压病人作了研究[12]，发现导致不同收缩压(Systolic Blood Pressure, SBP)的因素是血清中脂蛋白颗粒的组成，如脂肪酸侧链的不饱和度、脂蛋白分子之间相互作用的强度，而不是脂类的绝对含量。多种癌症[96,105](乳腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、脑肿瘤)、先天性障碍[102~104]等疾病在代谢组学方法的指引下也有了许多新的发现。最近，wang等[44]用代谢组学方法研究了血吸虫病对啮齿动物尿液代谢的影响，发现血吸虫的侵染严重扰乱了体内三羧酸循环等代谢过程，并对肠道菌群的代谢产生了影响。可以预见，代谢组学在分子病理和疾病诊断等领域将有广阔的应用前景。
4.2 营养代谢组学
代谢组学的方法可以帮助识别和常量营养物的最终摄入效应密切相关的代谢物，并且有助于定义各种常量营养物的正常摄入范围。从长远来看，代谢组学的研究可以帮助理解当单一的养分(如氨基酸等)摄入过多或者过少时整个机体的新陈代谢会发生怎样的改变。除此之外，这也是一个在考虑到代谢的复杂性的基础上合乎科学地建立常量营养物的合理摄入范围的评估策略。
Solanky 等[106]对进食含有(结合态或非结合态)大豆异黄酮的食物的女性的尿液进行了检测。结果发现，由于大豆异黄酮的摄入，导致了尿液中的氧化三甲胺明显升高，对氧化三甲胺的升高有两种可能的解释：(1)动物实验表明大豆蛋白对损伤的肾脏有明显的保护作用，而氧化三甲胺含量的升高以及伴随发生的甜菜碱、胆碱、肌酸和肌酐含量的变化，标志着肾功能的增强；(2)氧化三甲胺、甜菜碱、胆碱等都是微生物代谢的中间产物，因此进食含有丰富大豆异黄酮的食物，可能扰动了肠道微生物菌群。谷氨酸和谷氨酰胺的上升表明三羧酸(TCA) 循环受到了影响，因为它们可以很容易转化成TCA 循环的中间产物。另外柠檬酸的下降和糖含量的改变标
志着糖酵解速率的下降，从而影响到糖类的代谢。而甲胺通路的中间产物以及胆碱、甜菜碱、甘氨酸和乙酸盐的含量变化表明脂类和胆固醇的代谢、转移发生了改变。以上结果显示出基于NMR的代谢组学能够给出复杂生物体系对饮食改变的精细生
化响应。
几个世纪以来，菊花茶作为一种功能性饮料一直为人类所饮用，起到抗炎、抗氧化和抗菌等保健作用。Wan g等[107]对持续饮用欧洲黄菊的志愿者的尿液进行了分析，通过正交信号校正的模式识别方法排除了性别、饮食的影响，提取出了仅仅和此花摄入有关的代谢信息。研究结果表明：由于菊花的抗氧化作用导致了尿液中的肌酸酐的下降，而马尿酸和苯乙酰基谷酰胺含量的上升则表明了由于菊花的抗菌作用对人体肠道菌群产生了一定的影响，而这种影响最终造成了什么效果等问题还有待进一步回答。
4.3 功能基因组的研究
代学组学应用于功能基因组学是基于这样一种观点：基因产生变异的生物体在生长速率等表型上可能没有显著的改变，这是因为细胞内的代谢物浓度的改变补偿了变异产生的影响。但是这也同时意味着生物体在代谢表型上可能会有显著的变化[108]。譬如，无论从遗传还是代谢的角度看，传统认为，Han Wistar (HW)和Sprague Dawley (SD) 两个大鼠系十分接近，而且两个系均广泛地被用于药物的研制。可是代谢组学研究发现，它们的尿液代谢组有本质的区别。Bundy等[11,109]用代谢组学方法研究蚯蚓的表型时发现，几种形态上并无区别的蚯蚓，其体腔液(coelomic fluids)和组织代谢组有明显的区别。这些例子都表现出代谢组学方法的高灵敏性。
剔除或过表达蛋白编码基因很可能导致多种代谢物的浓度发生变化，因此理论上定量研究变异产生的代谢物浓度的相对变化有可能可以识别基因产物的作用位点。另外，由于具有相似变化的基因具有相似的功能，所以可以将剔除一个未知功能的基因所产生的细胞代谢上的变化，与剔除已知功能基因所产生的代谢变化进行比较，
从而确定未知基因的功能，这就为我们研究基因的生物学功能提供了理论依据和新的途径。了解基因变异带来的功能上的改变对于建立和验证新的人类疾病模型有着非常重要的意义。而且用代谢组学的方法评价基因修饰在植物改良中的安全性也有着巨大的潜力。
Raamsdonk等[19]利用FANCY(Functional ANalysis by Co-responses in Yeast)方法对野生型FY23及其6种突变株进行了研究。这6种突变株分别是选择性剔除了PFK26、PFK27、PET27、PET191、COX5a和ρ。在培养的指数生长中期分别对其代谢物进行提取，并获取1H NMR谱。实验数据的PCA方法分析结果表明，代谢组学方法能对具有相关生物活性的基因进行分类，能正确地区分性质上相似、程度上不同的表型突变。甚至基因表型缄默的几种突变体也能够被明显区分为呼吸缺陷突变体、部分呼吸缺陷突变体和控制组三类。
代谢组学还参与到了BAIR(Biological Atlas of Insulin Resistance) 计划当中。BAIR计划是由英国伦敦大学帝国理工学院、女王玛丽与威斯特菲尔德学院，剑桥大学和牛津大学合作，由英国Wellcome Trust功能基因组发展倡议基金资助的一个项目(https://www.doczj.com/doc/7c16538192.html,/) ，其目标是用包括代谢组学在内的各种组学、生物信息学、啮齿动物基因打靶、人类遗传学以及结构生物学等手段，研究胰岛素作用和导致胰岛素抵抗的分子机制，并对处于正常或紊乱状态的胰岛素行为作出系统的分子描述，以对人类的迟发糖尿病、肥胖症、高血压和冠心病等疾病作出相应的解释，从而使人类能更合理、有效的处理和防止这类疾病的发生。
5 机遇和挑战
整体来讲，代谢组学研究仍然处于早期发展阶段，面临着方法学和广泛应用两方面的挑战。仪器和分析技术的发展，特别是基于计算机的模式识别和专家系统的发展将对基于NMR的代谢研究的进步产生巨大的推进作用。但是，仍有大量方法学上的问题需要解决：生物体系的复杂性决定了生物体液以及生物组织组成的复杂性，从而造成了NMR谱峰的重叠，对物质的归属和精确定量造成一定的影响；NMR方法的低灵敏度也是一直困扰NMR工作者的一个问题；现有的代谢组学数据分析方法对高含量物质浓度的变化有很好的识别能力，但是对低含量代谢物分析的准确性和可靠性都较低，然而在某些情况下这些低含量的物质往往携带了重要的信息。虽然科研工作者已经得到了大量与重要生理病理变化或基因变异等有关的标志性代谢物，但是离建立完整的诊断专家系统，实现诊断常规化还有很长的距离。
尽管代谢组学的应用领域已经涉及到功能基因组学、营养学、病理学、药理学、毒理学、植物学、微生物学、昆虫/动物、系统生物学等诸多领域，但是在这些领域里的代谢组学还有许多具体应用的潜在价值可以发掘。相信随着代谢组学应用的广度和深度的不断增加，我们将会更充分认识到其优越性，这也将为人类更高效、准确的评价药物的安全性、更全面的认知疾病过程，甚至于指导人类的营养健康、监测环境等提供一种有力的手段。
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注：本文为提供者整理翻译的，由于知识所限，错误在所难免，敬请原谅。如有问题可以查找原文。
代谢组学课堂知识总结 吴江13级生科三班130903030028 代谢组学概念 1.代谢组学用高通量，高敏度，高精确度的现代分析仪器跟踪有机物。代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物（MW<1000）。在食品安全领域，利用代谢组学工具发现农兽药等在动植物体内的相关生物标志物也是一个热点领域。其样品主要是动植物的细胞和组织的提取液。主要技术手段是核磁共振（NMR），质谱（MS），色谱（HPLC，GC）及色谱质谱联用技术。通过检测一系列样品的NMR 谱图，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的病理生理状态，并有可能找出与之相关的生物标志物（biomarker）。 2.代谢组学研究方法 代谢组学的研究方法与蛋白质组学的方法类似，通常有两种方法。一种方法称作代谢物指纹分析（metabolomic fingerprinting），采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法，比较不同血样中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。从本质上来说，代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。另一种方法是代谢轮廓分析（metabolomic profiling）,研究人员假定了一条特定的代谢途径，并对此进行更深入的研究。 3.HPLC:高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 4.GC: 在这类仪器中，由于质谱仪工作原理不同，又有气相色谱-四极质谱仪，气相色谱-飞行时间质谱仪，气相色谱-离子阱质谱仪等。 代谢组学的应用 1.代谢组学在微生物里的应用对微生物的分类及筛选及功能研究。微生物发酵。 2.代谢组学在药物研究及疾病研究中的应用。通过动物体内的某种类型方法进行药物的筛选。效果的测定的药物作用的机制及临床表现及其评价。 3.代谢组学在生活中的应用食品加工食品产生。 气相色谱分析 1.气相色谱分析(chromatography)是使混合物中各组分在两相间进行分配，其中一相是不动的（固定相）,另一相（流动相）携带混合物流过此固定相，与固定相发生作用，在同一推动力下，不同组分在固定相中滞留的时间不同，依次从固定相中流出，又称色层法或者层析法。按流动相可分为气相色谱(GC)和液相色谱(LC) 2.GC是以惰性气体作为流动相，利用试样中各组分在色谱柱中的气相和固定相间的分配系
代谢组学的研究方法和研究流程分子微生物学１12３０0０0３林兵 随着人类基因组计划等重大科学项目的实施，基因组学、转录组学及蛋白质组学在研究人类生命科学的过程中发挥了重要的作用，与此同时, 代谢组学(ｍｅtaｂoloｍiｃs）在2０世纪90年代中期产生并迅速地发展起来，与基因组学、转录组学、蛋白质组学共同组成系统生物学。基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等各种组学0在生命科学领域中发挥了重要的作用，它们分别从调控生命过程的不同层面进行研究, 使人们能够从分子水平研究生命现象, 探讨生命的本质, 逐步系统地认识生命发展的规律.这些组学手段加上生物信息学, 成为系统生物学的重要组成部分。 代谢组学的出现和发展是必要的, 同时也是必须的。对于基因组学和蛋白质组学在生命科学研究中的缺点和不足, 代谢组学正好可以进行弥补。代谢组学研究的是生命个体对外源性物质（药物或毒物)的刺激、环境变化或遗传修饰所做出的所有代谢应答, 并且检测这种应答的全貌及其动态变化。代谢组学方法为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手段, 同时也为新药临床前安全性评价与实践提供了新的技术支持与保障. 1 代谢组学的概念及发展 代谢组学最初是由英国帝国理工大学Ｊereｍｙ N ichｏｌson教授提出的，他认为代谢组学是将人体作为一个完整的系统，机体的生理病理过程作为一个动态的系统来研究, 并且将代谢组学定义为生物体对病理生理或基因修饰等刺激产生的代谢物质动态应答的定量测定。20０0年，德国马普所的Fｉeｈn等提出了代谢组学的概念，但是与Ｎ ichoｌs ｏn提出的代谢组学不同, 他是将代谢组学定位为一个静态的过程，也可以称为/代谢物组学, 即对限定条件下的特定生物样品中所有代谢产物的定性定量分析。同时Ｆieｈn还将代谢组学按照研究目的的不同分为4类: 代谢物靶标分析，代谢轮廓（谱)分析, 代谢组学，代谢指纹分析。现在代谢组学在国内外的研究都在迅速地发展, 科学家们对代谢组学这一概念也进行了完善, 作出了科学的定义: 代谢组学是对一个生物系统的细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定性定量分析，从而定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学。 与基因组学、转录组学、蛋白质组学相同, 代谢组学的主要研究思想是全局观点。与传统的代谢研究相比, 代谢组学融合了物理学、生物学及分析化学等多学科知识, 利用现代化的先进的仪器联用分析技术对机体在特定的条件下整个代谢产物谱的变化进行检测，并通过特殊的多元统计分析方法研究整体的生物学功能状况。由于代谢组学的研究对象是人体或动物体的所有代谢产物, 而这些代谢产物的产生都是由机体的内源性物质发生反应生成的，因此，代谢产物的变化也就揭示了内源性物质或是基因水平的变化，这使研究对象从微观的基因变为宏观的代谢物，宏观代谢表型的研究使得科学研究的对象范围缩小而且更加直观，易于理解, 这点也是代谢组学研究的优势之一. 代谢组学的优势主要包括：对机体损伤小，所得到的信息量大，相对于基因组学和蛋白质组学检测更加容易。由于代谢组学发展的时间较短, 并且由于代谢组学的分析对象是无偏向性的样品中所有的小分子物质，因此对分析手段的要求比较高, 在数据处理和模式识别上也不成熟，存在一些不足之处。同时生物体代谢物组变化快, 稳定性较难控制，当机体的生理和药理效应超敏时，受试物即使没有相关毒性，也可能引起明显的代谢变化，导致假阳性结果。 代谢组学应用领域大致可以分为以下7个方面：
植物代谢组学的研究方法及其应用 ★★★ BlueGuy(金币+3)不错，谢谢！ 近年来，随着生命科学研究的发展，尤其是在完成拟南芥(Arabidopsis thaliana) 和水稻(Oryza sativa) 等植物的基因组测序后，植物生物学发生了翻天覆地的变化。人们已经把目光从基因的测序转移到了基因的功能研究。在研究DNA 的基因组学、mRNA 的转录组学及蛋白质的蛋白组学后，接踵而来的是研究代谢物的代谢组学(Hall et al.，2002)。代谢组学的概念来源于代谢组，代谢组是指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物，代谢组学则是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科(Goodacre，2004)。它是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支。 代谢物是细胞调控过程的终产物，它们的种类和数量变化被视为生物系统对基因或环境变化的最终响应(Fiehn，2002)。植物内源代谢物对植物的生长发育有重要作用(Pichersky and Gang，2000)。植物中代谢物超过20万种，有维持植物生命活动和生长发育所必需的初生代谢物；还有利用初生代谢物生成的与植物抗病和抗逆关系密切的次生代谢物，所以对植物代谢物进行分析是十分必要的。 但是，由于植物代谢物在时间和空间都具有高度的动态性(stitt and Fernie，2003)。尤其是次生代谢物种类繁多、结构迥异，且产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，难于进行分离分析，所以人们一直在寻找更为强大的检测分析工具。在代谢物分析领域，人们已经提出了目标分析、代谢产物指纹分析、代谢产物轮廓分析和代谢表型分析、代谢组学分析等概念。20世纪90年代初，Sauter 等(1991)首先将代谢组分析引入植物系统诊断，此后关于植物代谢组学的研究逐年增多。随着拟南芥等植物的基因组测序完成以及代谢物分析手段的改进和提高，今后几年进入此研究领域的科学家和研究机构将越来越多。 1研究方法 代谢组学分析流程包括样品制备、代谢物成分分析鉴定和数据分析与解释。由于植物中代谢物的种类繁多，而目前可用的成分检测和数据分析方法又多种多样，所以根据研究对象不同，采用的样品制备、分离鉴定手段及数据分析方法各不相同。 1.1样品制备 植物代谢物样品制备分为组织取样、匀浆、抽提、保存和样品预处理等步骤(Weckwerth and Fiehn，2002)。代谢产物通常用水或有机溶剂(如甲醇和己烷等)分别提取，获得水提取物和有机溶剂提取物，从而把非极性的亲脂相和极性相分开。分析之前，通常先用固相微萃取、固相萃取和亲和色谱等方法进行预处理(邱德有和黄璐琦，2004)。然而植物代谢物千差万别，其中很多物质稍受干扰结构就会发生改变，且对其分析鉴定所采用的设备也不同。目前还没有适合所有代谢物的抽提方法，通常只能根据所要分析的代谢物特性及使用的鉴定手段选择合适的提取方法。而抽提时间、温度、溶剂成分和质量及实验者的技巧等诸多因素也将影响样品制备的水平。
Botanical Research 植物学研究, 2016, 5(1), 26-33 Published Online January 2016 in Hans. https://www.doczj.com/doc/7c16538192.html,/journal/br https://www.doczj.com/doc/7c16538192.html,/10.12677/br.2016.51005 Application of Metabolomics in Plant Research Guixiao La1, Xi Hao1, Xiangyang Li1, Mingyi Ou2, Tiegang Yang1* 1Industrial Crops Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou Henan 2China Tobacco Guizhou Industrial Co. Ltd., Guiyang Guizhou Received: Dec. 10th, 2015; accepted: Dec. 25th, 2015; published: Dec. 30th, 2015 Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.doczj.com/doc/7c16538192.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Metabolomics is an emerging omics technology after genomics and proteomics, which can qualify and quantify all small molecular weight metabolites in an organism or cells in a short time. With the technology development of gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS), liquid chroma-tography-mass spectrometer (LC-MS) and capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS), and the improvement of data process method and presented huge advantages, plant metabolomics has been used in multiple research fields such as functional genomics, metabolism pathway, crop improvement... In this paper, we reviewed the recent progress in plant metabolomics and the put-ative problem in this research field. Moreover, the application prospects of the plant metabolom-ics were also forecasted. Keywords Metabolomics, Plant, Advance, Prospect 代谢组学在植物研究领域中的应用 腊贵晓1，郝西1，理向阳1，欧明毅2，杨铁钢1? 1河南省农业科学院经济作物研究所，河南郑州 2贵州中烟工业有限责任公司，贵州贵阳 *通讯作者。
代谢组学在医药领域的应用与进展 一、学习指导 1.学习代谢组学的概念及内涵，掌握代谢组学的研究对象与分析方法。 2.熟悉代谢组学数据分析技术手段 3.了解代谢组学优势特点 4.了解代谢组学在医药领域的应用 5.了解代谢组学发展趋势 二、正文 基因组功能解析是后基因组时代生命科学研究的热点之一，由于基因功能的复杂性和生物系统的完整性，必然要从“整体”层面上来理解构成生物体系的各个模块功能。随着新的测量技术、高通量的分析方法、先进的信息科学和系统科学新理论的发展，加上生物学研究的深入和生物信息的大量积累，使得在系统水平上研究由分子生物学发现的组件所构成的生命体系成为可能[1]。系统生物学家们认为，将生命科学上升为“综合”科学的时机已经成熟，生命科学再次回到整合性研究的新高度，逐步由分子生物学时代进入到系统生物学时代[2]。系统生物学不同以往的实验生物学仅关注个别基因和蛋白质，它要研究所有基因、蛋白质，代谢物等组分间的所有相互关系，通过整合各组成成分的信息，以数学方法建立模型描述系统结构[3,4]。 （一）代谢组学的概念及内涵 代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后，系统生物学的重要组成部分，也是目前组学领域研究的热点之一。代谢组学术语在国际上有两个英文名，即metabolomics 和metabonomics。Metabolomics是由德国的植物学家Fiehn等通过对植物代谢物研究提出来的，认为代谢组学（metabolomics）是定性和定量分析单个细胞或单一类型细胞的代谢调控和代谢流中所有低分子量代谢产物，从而监测机体或活细胞中化学变化的一门科学[5]。英国Nicholson研究小组从毒理学角度分析大鼠尿液成份时提出了代谢组学（Metabonomics）的概念，认为代谢组学是通过考察生物体系受扰动或刺激后（如某个特定基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或代谢产物随时间的变化来研究生物体系的代谢途径的一种技术[6]。国内的代谢组学研究小组基本用metabonomics一词来表示“代谢组学”。严格地说，代谢组学所研究的对象应该包括生物系统中所有的代谢产物。但由于实际分析手段的局限性，只对各种代谢路径底物和产物的小分子物质（MW<1Kd）进行测定和分析。 （二）代谢组学优势特点 代谢组学作为系统生物学的一个重要组成部分，代谢组可以更好地反映体系表型生物机体是一个动态的、多因素综合调控的复杂体系，在从基因到性状的生物信息传递链中，机体需通过不断调节自身复杂的代谢网络来维持系统内部以及与外界环境的正常动态平衡[7]。
药用植物代谢组学的研究进展 【摘要】从技术步骤、分析方法以及实际应用三个方面对当前药用植物代谢组学研究领域的一些理论问题和实践中面临的挑战进行综述。 【关键词】药用植物;代谢组学;功能基因组学 代谢组学是对生物体内代谢物进行大规模分析的一项技术[1],它是系统生物学的重要组成部分(如图1所示),药用植物代谢组学主要研究外界因素变化对植物所造成的影响,如气候变化、营养胁迫、生物胁迫,以及基因的突变和重组等引起的微小变化,是物种表型分析最强有力的工具之一。在现代中药研究中,代谢组学在药物有效性和安全性、中药资源和质量控制研究等方面具有重要理论意义和应用价值。另外,在对模式植物突变体文库或转基因文库进行分析之前,代谢组学往往是首先考虑采用的研究方法之一。目前,国外已有成功利用代谢组学技术对拟南芥突变株进行大规模基因筛选的例子,这为与重要性状相关基因功能的阐明和选育可供商业化利用的转基因作物奠定了基础 目前,还有许多经济作物的全基因组测序计划尚未完成,由于代谢组学研究并不要求对基因组信息的了解,所以在与这些作物有关的研究领域具有更大的利用价值,这也是其与转录组学和蛋白组学研究相比的优势之一。代谢组学研究涉及与生物技术、分析化学、有机化学、化学计量学和信息学相关的大量知识,Fiehn[2]对代谢组学有关的研究方向进行了分类(见表1)。 1代谢组学研究的技术步骤 代谢组学研究涉及的技术步骤主要包括植物栽培、样本制备、衍生化、分离纯化和数据分析5个方面(见图2)。 1.1植物栽培 对研究对象进行培育的目的是为了对样本的稳定性进行控制,相对于微生物和动物而言,植物的人工栽培需要考 表1代谢组学的分类及定义略 虑更多的问题,如中药材在不同年龄、不同发育阶段、不同部位以及光照、水肥、耕作等环境因素的微小差异都可引起生理状态的变化,而这些非可控及可控双重因素的影响很难进行精确的控制,从而影响药用植物代谢组研究的重复性。为了解决以上问题,推荐使用大容量的培养箱[3],定时更换培养箱中栽培对象的位置,以及使用无土栽培技术等,Fukusaki E[4]利用无土栽培系统将水和养分直接引入植物根部,并且对供给量进行精确地控制,大大提高了实验的重复性。 1.2样本制备 为了获得稳定的实验结果,样本制备需要考虑样本的生长、取样的时间和地点、取样量以及样本的处理方法等问题,并根据分析对象的分子结构、溶解性、极性等理化性质及其相对含量大小对提取和分离的方法进行选择,逐一优化试验方案。Maharjan RP等[5]用6种方法分别对大肠杆菌中代谢产物进行提取,发现用-40℃甲醇进行提取的效果最好。现阶段代谢组学的分析对象主要集中在亲水性小分子,尤其是初级代谢产物,气相色谱 质谱联用(GC MS)和毛细管电泳 质谱(CE MS)联用都是分析亲水小分子的重要技术。Fiehn O等[6]使用GC MS 对拟南芥叶片中的亲水小分子进行了分析,发现酒石酸半缩醛、柠苹酸、别苏氨酸、羟基乙酸等15种植物代谢物。 1.3衍生化处理 对目标代谢产物的衍生化处理取决于所使用的分析设备,GC MS系统只适
代谢组学技术及其在中医研究中的探讨 姓名：郭欣欣学号：22009283 导师：刘慧荣 代谢组学(metabonomics) 是20世纪90年代中期发展起来的一门新兴学科,是关于生物体系受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后) 其代谢产物(内源代谢物质) 种类、数量及其变化规律的科学。它研究的是生物整体、系统或器官的内源性代谢物质的代谢途径及其所受内在或外在因素的影响。常用的方法是检测和量化一个生物整体代谢随时间变化的规律;建立内在和外在因素影响下,代谢整体的变化轨迹,反映某种病理(生理) 过程中所发生的一系列生物事件。 1 代谢组学研究技术平台 代谢组学研究的技术平台包括以下几个部分:前期的样品制备,中期的代谢产物检测、分析与鉴定以及后期的数据分析与模型建立。 前期代谢组学研究常用的检测技术,一般不需要对标本行特别的分离、纯化等。但离体条件下,细胞或组织内的代谢状态可迅速改变,代谢物的质与量亦随之变化,为正确反映在体的真实信息,须立即阻断内在酶的活性。最为常用的是冰冻/液氮降温法及冷冻、干燥的保存技术,尽管如此,细胞间仍始终有一低水平的代谢活动,需尽量避免氧化等活化因素。 中期代谢产物的检测、分析与鉴定是代谢组学技术的核心部分,最常用的是NMR及质谱(MS)两种。 核磁共振技术是利用高磁场中原子核对射频辐射的吸收光谱鉴定化合物结构的分析技术,生命科学领域中常用的是氢谱( 1H NMR ) 、碳谱(13C NMR)及磷谱(31P NMR)三种。可用于体液或组织提取液和活体分析两大类。 NMR技术在代谢组学中的应用越来越广泛,它具有如下优点: ①无损伤性,不破坏样品的结构和性质; ②可在一定的温度和缓冲范围内进行生理条件或接近生理条件的实验; ③与外界特定干预相结合,研究动态系统中机体化学交换、运动等代谢产物的变化规律; ④实验方法灵活多样。但仪器价格及维护费用昂贵限制了该技术的进一步普及。 质谱技术是将离子化的原子、分子或是分子碎片按质量或是质荷比(m/e)大小顺序排列成图谱,并在此基础上,进行各种无机物、有机物的定性或定量分析。新的离子化技术则使质谱技术的灵敏度和准确度均有很大程度的提高。NMR技术与MS技术相比,各有其优缺点,需要在研究中灵活选用。总体而言,NMR技术应用的更为广泛。此外,根据代谢组学的研究需要,还常用于其他的一些分析技术,如气相色谱(GC) ,高效液相色谱仪(HPLC) ,高效毛细管电泳(HPCE)等。它们往往与NMR或MS技术联用,进一步增加其灵敏性。但不容忽视的是,随着分析手段更新,敏感性及分辨率提高,“假阳性”的概率也就越大,可能是仪器技术方法固有的，亦或是数据分析过程中产生的。 后期代谢组学研究的后期需借助于生物信息学平台。它往往借助于一定的软件,联合多种数据分析技术,将多维、分散的数据进行总结、分类及判别分析,发现数据间的定性、定量关系,解读数据中蕴藏的生物学意义,阐述其与机体代谢的关系。如果说分析技术在我们面前打开了“一扇门”,正确的数据分析方法和模型建立便是“找到宝藏”的钥匙。 主成分分析法( PCA) 是最常用的分析方法。其将分散于一组变量上的信息集中于几个综合指标(PC)上,如糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢等,利用主成分描述机体代谢的变化情况,发挥了降维分析的作用,避免淹没于大量数据中。其他的模式识别技术,如聚类分析、辨别式功能分析、最小二乘法投影法等在代谢组学研究中亦有其重要的地位。 现实情况下,代谢组学的数据更为复杂,特别是NMR对病理生理过程的研究,将代谢物的表达谱与时间相联系,分析时更加困难,需要借助复杂的模型或是专家系统进行分析(在应用
代谢组学综述 摘要：代谢组学是20世纪90年代中期发展起来的对某一生物或细胞所有低相对分子质量代谢产物进行定性和定量分析的一门新学科,由于其广泛的应用前景,目前已成为系统生物学的重要组成部分。现简要介绍了代谢组学的含义、代谢组学研究的历史沿革、当前代谢组学研究中的分析技术、数据解析方法,综述了代谢组学在药物毒理学研究、疾病诊断、植物和中药等领域的应用情况,并对当前代谢组学研究中存在的问题及发展趋势进行探讨。 关键词：代谢组学研究技术 随着人类基因组计划等重大科学项目的实施,基因组学、转录组学及蛋白质组学在研究人类生命科学的过程中发挥了重要的作用, 与此同时, 代谢组学（metabolomics）在20世纪90年代中期产生并迅速地发展起来, 与基因组学、转录组学、蛋白质组学共同组成系统生物学。基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等各种组学0在生命科学领域中发挥了重要的作用, 它们分别从调控生命过程的不同层面进行研究, 使人们能够从分子水平研究生命现象, 探讨生命的本质, 逐步系统地认识生命发展的规律。这些组学手段加上生物信息学, 成为系统生物学的重要组成部分。 代谢组学的出现和发展是必要的, 同时也是必须的。对于基因组学和蛋白质组学在生命科学研究中的缺点和不足, 代谢组学正好可以进行弥补。代谢组学研究的是生命个体对外源性物质(药物或毒物)的刺激、环境变化或遗传修饰所做出的所有代谢应答, 并且检测这种应答的全貌及其动态变化。代谢组学方法为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手段, 同时也为新药临床前安全性评价与实践提供了新的技术支持与保障。 1 代谢组学的概念及发展 代谢组学最初是由英国帝国理工大学Jeremy N icholson教授提出的, 他认为代谢组学是将人体作为一个完整的系统, 机体的生理病理过程作为一个动态的系统来研究, 并且将代谢组学定义为生物体对病理生理或基因修饰等刺激产生的代谢物质动态应答的定量测定。2000年, 德国马普所的Fiehn等提出了代谢组学的概念, 但是与N icholson提出的代谢组学不同, 他是将代谢组学定位为一个静态的过程, 也可以称为/代谢物组学, 即对限定条件下的特定生物样品中所有代
2016-02，37（1）中国烟草科学 Chinese Tobacco Science 89 代谢组学技术在烟草研究中的应用进展 王小莉，付博，赵铭钦*，贺凡，王鹏泽，刘鹏飞 （河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州 450002） 摘要：简述了作为研究植物生理生化和基因功能新方法的代谢组学在烟草研究中的主要技术流程及其应用现状，归纳了不同生态环境和不同组织中烟草代谢物差异及产生原因，总结了生物和非生物胁迫及化学诱导处理等条件下的烟草生理生化变化及相关基因功能。最后提出了目前烟草代谢组学研究所面临的问题，并指出与其他组学整合应用是代谢组学在烟草研究领域的发展趋势。 关键词：烟草；代谢组学；胁迫；化学诱导；基因功能 中图分类号：S572.01 文章编号：1007-5119（2016）01-0089-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.016 Research of Metabolomics in Tobacco WANG Xiaoli, FU Bo, ZHAO Mingqin*, HE Fan, WANG Pengze, LIU Pengfei (College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, National Tobacco Physiology and Biochemistry Research Center, Zhengzhou 450002, China) Abstract: Metabolomics has been considered one of the most effective means of investigating physiological and biochemical processes and gene function of plants. Here we review the main process of metabolomics and its application status in tobacco research, the regulation mechanisms of physiological and biochemical reactions when tobacco responds to different environmental, biotic and abiotic stresses, chemically induced processes and genetic modifications. Finally, issues of critical significance to current tobacco metabolomics research are discussed and it is noted that integration with other omics is the trend of metabolomics research in tobacco. Keywords: tobacco; metabolomics; stress; chemical induction; gene function 代谢组学与基因组学、转录组学和蛋白质组学分别从不同层面研究生物体对环境或基因改变的响应，它们都是系统生物学的重要组成部分。植物代谢组学是21世纪初产生的一门新学科，主要通过研究植物的次生代谢物受环境或基因扰动前后差异来研究植物代谢网络和基因功能[1-2]。与微生物和动物相比，植物的独特性在于它拥有复杂的代谢途径，目前发现的次生代谢产物达20万种以上[3]。代谢物差异是植物对基因或环境改变的最终响应[4]，因此，对代谢物进行全面解析，探索相关代谢网络和基因调控机制，是从分子层面深入认识植物生命活动规律的一个重要环节[5-7]。 烟草不仅是重要的经济作物，同时还是一种重要的模式植物，作为生物反应器在研究植物遗传、发育、防御反应和转基因等领域中具有重要意义[8-10]。烟草代谢物非常丰富，目前从烟叶中已鉴定出3000多种[11]，且代谢物理化性质和含量差异较大，给烟草化学及代谢规律研究带来挑战。传统的烟草化学主要集中于研究某一类化学成分或某几种重要物质，如萜类[12]、生物碱类[13]、多酚类等[14]，这很难全面地系统地阐述烟草代谢网络。随着系统生物学的发展，烟草越来越广泛地被用于基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学的研究中，例如采用系统生物学的方法找出 基金项目：中国烟草总公司浓香型特色优质烟叶开发（110201101001 TS-01）；上海烟草集团责任有限公司“浓香型特色优质烟叶风格定位研究及样品检测”（szbcw201201150） 作者简介：王小莉（1983-），女，博士研究生，主要从事烟草生理生化研究。E-mail：xiaoliwang325@https://www.doczj.com/doc/7c16538192.html, *通信作者，E-mail：zhaomingqin@https://www.doczj.com/doc/7c16538192.html, 收稿日期：2015-09-09 修回日期：2015-11-19
代谢组学及其发展 摘要：代谢组学是上世纪九十年代中期发展起来的一门新兴学科，是系统 生物学的重要组成部分。它是关于生物体系内源代谢物质种类、数量及其变化规律的科学，研究生物整体、系统或器官的内源性代谢物质及其所受内在或外在因素的影响。 关键词：代谢组学，研究方法，组学运用，中药学 1 代谢组学 代谢组学(metabonomics/metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。 2代谢组学的研究方法 2.1研究范围 代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物（MW<1000）。在食品安全领域，利用代谢组学工具发现农兽药等在动植物体内的相关生物标志物也是一个热点领。其样品主要是动植物的细胞和组织的提取液。 2．2常用的分析技术 主要技术手段是代谢组学以液相色谱一质谱(LC．MS)、气相色谱-质谱(GC．Ms)、核磁共振谱(NMR)等方法为主要研究手段[1.2.3]，其中以NMR为主。通过检测一系列样品的NMR 谱图，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的病理生理状态，并有可能找出与之相关的生物标志物（biomarker）。为相关预警信号提供一个预知平台。 据不同的研究对象和研究目的，Fiehn 将生物体系的代谢产物分析分为4个层次：(1)代谢物靶标分析对某个或某几个特定组分的分析。在这个层次中，需要采取一定的预处理技术除掉干扰物，以提高检测的灵敏度。(2)代谢轮廓(谱)分析对少数所预设的一些代谢产物的定量分析。如某一类结构、性质相关的化合物，某一代谢途径的所有中间产物或多条代谢途径的标志性组分。进行代谢轮廓(谱)分析时，可以充分利用这一类化合物的特有的化学性质，在样品的预处理和检测过程中，采用特定的技术来完成。(3)代谢组学是在限定条件下对特定生物样品中所有内源性代谢组分的定性和定量分析。进行代谢组学研究时，样品的预处理和检测技术必须满足对所有的代谢组分具有高灵敏度、高选择性、高通量的要求，而且基体干扰要小。代谢组学涉及的数据量非常大，因此需要有能对其数据进行解析的化学计量学技术。代谢组学的最终目标是解析所有的可见峰。(4)代谢指纹分析不具体鉴定单一组分，而是通过比较代谢物指纹图谱的差异对样品进行快速分类。 2.3数据处理平台 应用NMR或MS得到的代谢组学数据是海量的多变量数据信息，需要利用模式识别(PR，pattern recognition)技术进行多元数据分析，将数据降维，然后对样本分类或寻找生物标志物(biomarker)，用来解释代谢表型(metabolic phenotypes)
０．前言 代谢组学是一种研究体内代谢产物的系统生物学方法，它能为疾病状态、药理毒理、基因功能的研究提供大量信息［１］，１９９９年Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ［２］将其定义为能定量测定生命系统对病理生理刺激或基因改变所产生的动态多参数代谢反应的一种方法（Ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓｉｓｄｅｆｉｎｅｄａｓ‘ｔｈｅｑｕａｎ－ｔｉｔａｔｉｖｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｌｉｖｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓｔｏｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｉｍｕｌｉｏｒｇｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ’）。它是继基因组学、蛋白质组学、转录组学后新近发展起来的一门新的组学，并与基因组学、蛋白质组学、转录组学等共同构成系统生物学。代谢组学考查的是生物机体内所有的代谢产物［３］，但主要关注的是分子量在１０００以内的小分子物质，基因组学和蛋白质组学分别从基因和蛋白质层面探寻生命活动，代谢组学则从代谢物层面上探寻生命活动，基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确实发生了［４］。代谢产物能在一个生物体的细胞、细胞器、组织、器官、体液等各个层面上产生［５］，从某种意义上说机体内每一项生命活动都要受到代谢产物的调节和影响，因此，代谢组学研究可以了解和探索各项生命活动的整体代谢状况从而帮助人们更好地理解生命活动。目前代谢组学在药学、毒理学、疾病诊断、基因功能等生命科学的各个领域都有广泛应用，并已显示出其强大的优势，它在向各个学科渗透的同时，其自身技术和方法也在不断进步，随着系统生物学的发展，代谢组学正向真正的系统、综合、全面的目标迈进。 １．代谢组学的研究方法 代谢组学研究的基本方法是应用气相色谱质谱联用（ＧＣ－ＭＳ），液相色谱质谱联用（ＬＣ－ＭＳ），核磁共振波谱（ＮＭＲ）等先进的仪器分析技术来检测各种生物样品（包括血液、尿液、脑脊液、肝脏、病变组织等）中代谢物组的信息并结合模式识别和专家系统等分析计算方法对所得代谢组学数据进行处理，最后综合解析这些数据以探讨各种生命活动在代谢物层面上的规律和特征并用于评价药物疗效、检测药物毒性、诊断疾病、分析疾病状态等。代谢组学的技术平台主要包括样品制备、代谢产物检测和分析鉴定以及数据分析与模型建立。 ２．代谢组学的应用 ２．１代谢组学为药学和毒理学研究中的应用 目前，代谢组学在药物安全性评价、新药开发、毒性标志物的筛选等方面应用广泛。Ｎｉｃｈｏｌｌｓ［６］运用代谢组学技术对药物引起磷脂质病的机理进行了研究，结果发现大鼠给药后不同时段尿液代谢组图谱发生变化。研究认为代谢组学技术能为药物引起磷脂质病微小生化改变的检测提供强有力的工具。Ｓｌｉｍ［７］利用代谢组学方法研究了地塞米松对磷酸二酯酶抑制剂诱导的大鼠脉管炎的治疗作用，发现大鼠尿液代谢组图谱与组织病理变化基本一致，研究认为尿液代谢组图谱的变化可反映主要的病理变化，代谢组学技术可非侵害地检测血管变化。 在动物实验和临床试验中利用高通量的技术手段筛选和检测潜在的毒性物质是新药安全性评价的重要环节［８］，因为大多数药物通过广泛的生物转化作用可成为毒性明显不同的代谢物［９］，当毒物与细胞或组织相互作用时会引起机体关键代谢过程中内源性物质的比例和浓度发生变化，所以只有对这些代谢物的变化信息进行全面的分析研究才能更好地评价药物的安全性，大量研究表明代谢组学技术能快速获得这些信息［１０］，它可检测生物体在给药后整体的代谢反应过程，能综合考察药物的药效和毒性，能全面分析代谢产物的变化特点和规律，从而系统地评价药物的价值和开发前景。在毒理学研究中，代谢组学技术在研究毒物作用机制、预测药物毒性、鉴定对临床有用的生物标志物等方面发挥着重要作用［１１］。Ｗａｒｎｅ［１２］利用代谢组学技术研究３－三氟甲基－苯胺的毒 理反应，成功鉴定出了与毒性反应有关的潜在生物标志物。Ａｚｍｉ等［１３］利用代谢组学技术研究了１－萘异硫氰酸酯（１－Ｎａｐｈｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＡＮＩＴ）的肝毒性作用，研究认为代谢组学技术能够在器官、亚器官等不同水平上认识不同的毒理学机制。 鉴于代谢组学技术在药学和毒理学研究中的巨大贡献，英国帝国理工学院已与六家医药公司联合成立了名为毒理代谢组学（ｔｈｅＣｏｎｓｏｒ－ｔｉｕｍｆｏｒＭｅｔａｂｏｎｏｍｉｃＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ＣＯＭＥＴ）的研究组织，该组织旨在从方法学上建立一套毒理代谢组学研究体系和通用的标准评价方法，采用１ＨＮＭＲ技术分析尿液和血液代谢组信息以用于候选药物临床前的毒性检测［１４］。近来，Ｃｌａｙｔｏｎ［１５］又提出了药物代谢组学的概念（ｐｈａｒｍａｃｏ－ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｄｅｆｉｎｅａｓ‘ｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｕｔｃｏｍｅ（ｆｏｒｅｘ－ａｍｐｌｅ，ｅｆｆｉｃａｃｙｏｒｔｏｘｉｃｉｔｙ）ｏｆａｄｒｕｇｏｒｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｉｎａｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｂａｓｅｄｏｎａｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌｍｏｄｅｌｏｆｐｒｅ－ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ’）。 ２．２代谢组学在疾病研究和诊断中的应用 近年来，代谢组学技术已广泛应用于心血管疾病、糖尿病、癌症等疾病的诊断和研究。在心血管疾病方面，Ｂｒｉｎｄｌｅ［１６］利用基于１ＨＮＭＲ的代谢组学技术对冠心病人的血清代谢组进行了分析，结果显示疾病组与正常组代谢组图谱存在明显差异，研究认为代谢组学技术不仅能快速、准确的诊断冠心病还能区分疾病的严重程度。Ｍａｒｔｉｎ［１７］运用代谢组学技术研究了不同饮食对动脉粥样硬化形成的影响，结果发现极低密度脂蛋白（ＶＬＤＬ）、胆固醇（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、Ｎ－乙酰基糖蛋白（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｙ－ｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）与动脉粥样硬化的形成呈正相关，白蛋白赖氨酰残基（ａｌｂｕ－ｍｉｎｌｙｓｙｌｒｅｓｉｄｕｅｓ）、氧化三甲胺（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ－Ｎ－ｏｘｉｄｅ）与之呈负相关，此外，在预测动脉粥样硬化变性方面代谢组学数据可达８９％，而常规方法只有６０％，研究认为代谢组学技术不仅能区分不同饮食诱导的动脉粥样硬化的生物反应（尤其是多参数代谢反应），还能发现新的与疾病进程呈正相关或负相关的潜在标志物，从而帮助人们更好地认识疾病发病的危险因素。 在糖尿病方面，Ｈｏｄａｖａｎｃｅ［１８］认为代谢组学技术是研究２型糖尿病和胰岛素抵抗的有力工具，它能够识别那些常规方法无法识别的代谢产物。Ｙａｎｇ［１９］对比分析２型糖尿病人和正常人血清代谢组图谱发现２型糖尿病人的血清脂肪酸代谢谱与正常人存在差异，研究认为利用代谢组学方法检测血清脂肪酸代谢状况可快速诊断２型糖尿病。Ｙｕａｎ等［２０］对２型糖尿病人尿液进行代谢组学分析并发现了马来酸（Ｍａｌｅｉｃａｃｉｄ）、氧基乙酸（Ｏｘｙｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）、４－氨基苯甲酸（４－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）等与２型糖尿病有关的潜在生物标志物。 在癌症方面，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ［２１］认为代谢组学技术不仅能分析水溶性和脂溶性的癌组织提取物还能发现和鉴定在疾病不同阶段的特征性代谢产物，它是研究和诊断癌症的有力工具。Ｙａｎｇ等［２２］利用代谢组学技术对比分析了肝癌、肝炎、肝硬化患者及正常对照者的尿液代谢组信息，结果显示各组患者尿液代谢组信息存在明显差异，研究认为代谢组学技术不仅能清楚地区分患者和正常人还能诊断出患者是患肝炎、肝硬化还是肝癌，这对降低误诊率意义重大，研究还指出通过代谢组学技术鉴定出的尿液核苷在癌症诊断方面优于传统的肿瘤标志物甲胎蛋白（ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＦＰ）。 代谢组学不仅在上述影响人类健康的重大疾病中有广泛的应用，目前还应用于泌尿系统疾病［２３］、神经系统疾病［２４］、高血压［２５］、先天性代谢缺陷［２６］等疾病的研究和诊断。这些研究均表明代谢组学是疾病研究和诊断的有力工具，它的应用为疾病研究和诊断开辟了新的领域。 ２．３代谢组学在其它领域的应用 代谢组学凭借其独特的优势和应用潜力不仅在药学、毒理学、疾病 代谢组学技术及其应用的研究进展 苏州大学体育学院岳秀飞史晓伟 ［摘要］代谢组学是一种研究生物体内所有小分子代谢物的系统生物学方法，它利用气相色谱质谱联用(GC-MS)，液相色谱质谱 联用(LC-MS)，核磁共振波谱(NMR)等先进的仪器分析技术来检测各种生物样品中代谢物组的信息并结合模式识别等分析计算方 法对所得代谢组学数据进行处理，最后综合解析这些数据以用于评价药物疗效、检测药物毒性、诊断疾病、分析疾病状态。代谢组学 自提出以来发展十分迅速，目前已在药学、毒理学、疾病研究和诊断等领域得到广泛应用。本文主要对代谢组学的概念，研究方法及 其应用进行综述，最后就代谢组学的发展趋势作一讨论。 ［关键词］代谢组代谢组学核磁共振气相色谱质谱联用液相色谱质谱联用 ９５ ——
代谢组学的定义 代谢组学(metabolomics/metabonomics)[1, 2]是上世纪90 年代中期发展起来的一门新学科，它是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学，所关注的是代谢循环中分子量小于1000 的小分子代谢物的变化，反映的是外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢应答变化。代谢组学的概念来源于最初人们提出的“代谢物组”(metabolome)，即指某一生物或细胞所有代谢产物，后来发展为代谢组学的概念。其最主要的特征是通过高通量的实验和大规模的计算，从系统生物学的角度出发，全面地综合地考察机体的代谢变化。作为一种崭新的方法学，代谢组学已成为国际上疾病与健康研究的一个重要热点。 Nicholson 研究小组于1999 年提出了metabonomics 的概念[1]，并在疾病诊断、药物筛选等方面做了大量的卓有成效的工作[3, 4]。Fiehn 等[5]提出了metabolomics 的概念，第一次把代谢产物和生物基因的功能联系起来。之后很多植物化学家开展植物代谢组学的研究，使代谢组学得到了极大的发展，形成了当前代谢组学的两大主流领域：metabolomics 和metabonomics。前者是对生物系统整体的、动态的认识(不仅关心代谢物质的整体也关注其动态变化规律)，而后者强调分析且是个静态的认识概念，因此可以认为metabolomics 是metabonomics 的一个组成部分。代谢组学经过不断的发展，一些相关层次的定义已被学术界广泛接受。第一个层次为靶标分析，目标是定量分析一个靶蛋白的底物和/或产物；第二个层次为代谢轮廓分析，采用针对性的分析技术，对特定代谢过程中的结构或性质相关的预设代谢物系列进行定量测定；第三个层次为代谢指纹，定性或半定量分析细胞内外全部代谢物；第四个层次为代谢组分析，定量分析一个生物系统全部代谢物，其目前还难以实现。 目前，代谢组学已在药物毒性和机理研究[6-7]、微生物和植物研究[8,9]、疾病诊断和动物模型[10, 11]、基因功能的阐明[12]等领域获得了较广泛的应用，在中药成分的安全性评估[13]、药物代谢分析[14]、毒性基因组学[15]、营养基因组[16]、药理代谢组学[17-19]、整合药物代谢和系统毒理学[20, 21]等方面也取得了新的突破和进展代谢组学的具体研究方法是：运用核磁共振(NMR)、质谱(MS)、气质联用(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)等高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术，通过对细胞提取物、组织提取物、生物体液(血浆、血清、尿液、胆汁、脑脊液等)和完整的脏器组织等随时间变化的代谢物浓度进行检测，结合有效的模式识别方法进行定性、定量和分类，并将这些代谢信息与生理病理过程中的生物学事件关联起来，从而了解机体生命活动的代谢过程[22]。 基于核磁共振的代谢组学 作为众多化学分析方法中的一种，NMR 在代谢组学的研究中起着非常重要的作用。首先，NMR 分析生物体液或活体组织等复杂样品时，预处理过程简单，测试手段丰富，包括液体高分辨NMR、高分辨魔角旋转(HRMAS) NMR 和活体磁共振定域谱(MRS)，因此能够在最接近生理状态的条件下对不同类型的样品进行检测。其次，NMR 是一种无创性的多参数动态分析技术，同时具有定性分析和定量分析的能力；NMR 谱本身携带有丰富的分子结构和动力学信息，通过扫描生物样品可以得到其所有含NMR 可观测核的、且含量在NMR 检测限上的代谢物的特征NMR 谱。再次，NMR 检测可以在很短的时间内完成(一般5 ~ 10 分钟)，这对于实现高通量样品检测，并保证样品在检测期内维持原有生化性质至关重要。此外，低温探头、自动进样技术的出现和日趋完善，也使检测灵敏度和速度不断提高。最