实验三 蛋白酶的固态发酵及提取实验

实验一：从毛霉中提取蛋白酶及分离方案组员：李婷蒋丽花李英1 实验原理毛霉又叫黑霉、长毛霉接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属。

以孢囊孢子和接合孢子繁殖菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝，在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。

毛霉常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉。

许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。

工业中利用其蛋白酶以酿制腐乳、豆豉等。

皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。

蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。

酶活定义：在4 0℃， p H7.2条件下， 1分钟内水解酪蛋白产生 l微克酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位。

蛋白酶水解络蛋白，其产物络氨酸能在碱性条件下使福林-酚试剂还原，生产钼蓝与钨蓝，在680nm下测定其吸光度，可求得蛋白酶活力。

考马斯亮蓝是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。

蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。

一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。

而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，这种现象称为盐析。

在蛋白质的盐析中，硫酸铵最为常用，这是由于硫酸铵在水中的溶解度最低而且温度系数小不影响酶活性，分离效果好。

2 仪器恒温培养箱、振荡摇床、恒温振荡器、离心机、722分光光度计、pH计、恒温水浴锅3培养基斜面培养基PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL 煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10mL（视试管大小而定），121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

酶制剂的固态发酵法
酶制剂固态发酵法的过程是先将原料（如淀粉）与菌种混合，然后在一定的温度和湿度下进行发酵，以产生所需的酶。

该方法具有以下优点：
- 酶的品种多，新酶种容易得到。

- 菌种易诱变，代谢易调控。

- 生产周期短，酶的产量大。

- 基因易操控，优质种易得。

在固态发酵过程中，需要控制好温度和湿度，不需要调节pH。

发酵完成后，可以通过烘干、粉碎、过筛等方式得到粗酶粉，然后通过精制、加水抽提、分离去除固形物、浓缩、盐析或有机溶剂沉淀、离子交换层析等方式进一步纯化。

实验方案设计人：陈龙1．蛋白酶产生菌的分离1. 1 实验材料菌源：酱香型大曲1. 2 培养基的配制细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-25g、水1000ml；称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。

溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。

调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。

反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。

分装、包扎、灭菌。

霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1000ml；量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。

分装、包扎、灭菌。

产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.0g，Na2CO3 0.1g，自来水100ml PH 9.0（灭菌前）。

pH7．0。

配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。

选择培养基：豆粕粉10．0 g，琼脂15．0 g，蒸馏水1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30 min。

固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。

筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。

1. 3 试剂和溶液1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃珠。

一、实验目的1. 学习酵母蛋白的提取方法。

2. 掌握蛋白质的检测方法。

3. 了解酵母蛋白的生理活性。

二、实验原理酵母蛋白是一种重要的微生物蛋白，具有丰富的氨基酸组成和生理活性。

本实验采用酸法提取酵母蛋白，通过检测蛋白质含量和生理活性，验证提取方法的可行性。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：新鲜酵母菌（酿酒酵母）。

2. 试剂：盐酸、硫酸铵、NaOH、BCA蛋白定量试剂盒、生理盐水、生理盐酸盐缓冲液等。

四、实验步骤1. 酵母蛋白提取（1）将新鲜酵母菌接种于YPD培养基中，30℃培养24h。

（2）收集培养液，用无菌生理盐水洗涤酵母细胞3次。

（3）将洗涤后的酵母细胞用无菌生理盐水悬浮，加入适量盐酸（pH 4.5）。

（4）在冰浴条件下，用高速匀浆机将酵母细胞匀浆。

（5）将匀浆液离心（8000r/min，10min），取上清液即为酵母蛋白提取液。

2. 蛋白质含量检测（1）取适量酵母蛋白提取液，按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行操作。

（2）根据标准曲线计算蛋白质含量。

3. 生理活性检测（1）取适量酵母蛋白提取液，按照生理活性检测方法进行操作。

（2）根据检测结果，分析酵母蛋白的生理活性。

五、实验结果与分析1. 蛋白质含量检测结果通过BCA蛋白定量试剂盒检测，酵母蛋白提取液中的蛋白质含量为2.0mg/mL。

2. 生理活性检测结果通过生理活性检测，酵母蛋白提取液具有一定的生理活性。

六、实验结论本实验采用酸法提取酵母蛋白，通过检测蛋白质含量和生理活性，验证了提取方法的可行性。

酵母蛋白提取液具有较高的蛋白质含量和一定的生理活性，为后续研究提供了实验基础。

2. 蛋白酶的发酵与酶活力测定2.1 实验目的1）了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线。

2）了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。

2.2 实验原理将活化好的试验菌种制成菌悬液，转接到产蛋白酶发酵培养基，直接进行发酵培养，每隔3h取一次样，测量它的OD值，绘制产蛋白酶芽孢杆菌生长曲线。

蛋白酶在一定的温度与pH条件下水解酪素底物，产生含有酚基的氮基酸(如:酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力2.3实验仪器与实验材料：菌种：产蛋白酶芽孢杆菌斜面菌种；酶源：蛋白酶发酵液；培养基及试剂：牛肉膏蛋白冻液体培养基；酪素培养基、蛋白酶活力检测试剂仪器：紫外分光光度计、恒温水浴锅、量筒、试剂瓶、接种针、玻璃棒、移液枪、10ml离心管28-32个、试管4支、PH计等。

2.4 实验流程：第一天（2012年5月17日）实验内容：种子培养液与发酵培养液制备实验试剂：产蛋白酶芽孢杆菌菌种、种子培养液（不加琼脂的牛肉膏蛋白胨液体培养基）、发酵培养液（不加琼脂的酪素培养基，酪素减半，其余不变）、1mol/LNaOH、1mol/LHcl 实验器材：250ml锥形瓶3个、玻璃棒、接种环、100ml烧杯3个、胶头滴管1个、封口膜、标签、摇床、电子天平、PH计、10ml移液管、离心管13支等。

实验步骤：1、按配方配制牛肉膏蛋白冻液体培养基100ml作为种子培养液，装入250ml锥形瓶中2、按配方配制发酵培养液2份，各100ml装入250ml锥形瓶中（分别记为1号、2号）3、将实验所用器具（玻璃棒、接种环、移液管、试管）及培养基（250ml，用封口膜包扎）进行高压蒸汽灭菌（0.1MPa、121℃、20min）。

4、待培养基冷却后，在超净工作台上用接种环从斜面培养基上取2环产蛋白酶芽孢杆菌，接种到种子培养基内，放到摇床上，在31℃摇床培养16h。

发酵实验总结生物技术1002 1610100311 刘小波摘要：1、实验目的：通过本次实验，学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法，学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术，了解碱性蛋白酶活力测定的原理，掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。

2、实验方法：从玉米黄顶菊混种土壤中筛选蛋白酶，之后经液体发酵扩大培养，挑选出活力较强的菌落，通过碱性蛋白酶活力测定的方法测出蛋白酶活力的大小。

3、实验结果：实验原理：1、能够产生胞外蛋白酶的菌株在平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。

水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的筛选依据。

2、蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可以利用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。

本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，先对分子质量较小的仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。

在280nm 波长下测定溶液吸光度的增加，就可以计算酶的活力。

实验材料：玉米黄顶菊混种土样、酪蛋白、牛肉膏、磷酸氢二钠、氯化钠、琼脂、蒸馏水、0.02mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.5）、1%酪蛋白溶液、5%三氯醋酸（TCA）溶液、烧杯、试管、容量瓶、量筒、玻璃棒、移液枪、电子秤、高温高压灭菌锅、恒温培养箱、离心机、水浴锅、紫外线分光光度计等。

实验方法：蛋白酶的筛选：1、准确称取玉米黄顶菊混种土样10g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，用手震荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8一系列稀释菌液。

米曲霉固态发酵生产中性蛋白酶1、实验目的及要求：通过固态三角瓶培养曲霉，使学生掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法：2、实验原理、过程和方法2.1原理固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。

在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。

固态培养方法：（Solid state cultivation）：主要有散曲法和块曲法。

部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。

固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。

固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。

其主要优点是节能，无废水污染。

单位体积的生产效率较高。

我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。

故染菌问题未得到根本解决。

本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征：米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。

菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。

2.2过程米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。

米曲霉培养物经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。

2.3方法米曲霉的培养本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。

三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。

试管斜面培养基：豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。

每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。

或采用马铃薯培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15-20g 加水至1000ml pH自然。

实验二、蛋白酶的提取及分离
1.实验目的
通过本实验，了解硫酸铵分级沉淀蛋白质的原理，掌握分级沉淀蛋白酶的基本操作和方法。

2.实验原理
在蛋白酶溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵，硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析，不同盐浓度下蛋白质的溶解度是不同的，因此先后调节溶液不同的盐浓度，可使各种不同蛋白质先后沉淀出来，或使需要的酶蛋白与其他杂蛋白分开，从而达到提纯的目的。

这就是分级沉淀。

盐析法中溶液的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和溶液称为100%饱和度。

3.试剂和仪器设备
材料：章鱼内脏
试剂：0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5），浓盐酸，固体（NH4）2SO4
仪器设备：磁力搅拌机，pH计，冷冻离心机，研钵，分光光度计，分析天平，移液枪，剪刀。

4.实验步骤
取粗酶液100mL，根据体积和硫酸铵饱和度用量表，算出达到80%硫酸铵饱和度实际应加入到酶液中的硫酸铵的量，即51.6g，并称取该量硫酸铵。

将酶液倒入烧杯中，缓慢搅拌下缓缓加入称好的固体硫酸铵，边加入边搅拌，待硫酸铵全部加入后，再缓慢搅拌5min，4℃下放置20min。

将上述溶液倒入离心管，在2000r/min,，4℃下离心10min。

离心后取沉淀。

沉淀重量按湿重的50%计算。

将冻干粉配置成一定浓度的酶液，测定其酶活力。

第1篇一、实验背景酶作为一种生物催化剂，在生物化学、医药、食品加工等领域具有广泛的应用。

酶的提取是研究酶性质和应用的基础，本实验报告对酶的提取方法进行综述，包括提取原理、常用提取方法、提取条件以及应用前景等。

二、实验目的1. 了解酶的提取原理和常用提取方法。

2. 掌握酶提取过程中的关键因素，如pH、温度、溶剂等。

3. 分析酶提取在各个领域的应用前景。

三、实验原理酶的提取原理主要基于酶的物理和化学性质。

酶作为一种蛋白质，具有特定的三维结构，能够在特定的条件下发挥催化作用。

酶的提取通常包括以下步骤：1. 细胞破碎：将含有酶的细胞或组织破碎，释放酶蛋白。

2. 酶的纯化：通过层析、离心、沉淀等方法，将酶蛋白从其他蛋白质和杂质中分离出来。

3. 酶的稳定化：通过添加稳定剂等方法，提高酶的稳定性。

四、实验方法1. 细胞破碎方法：- 机械破碎：采用研磨、超声波等方法。

- 化学破碎：采用酶解、溶胀等方法。

2. 酶的纯化方法：- 离心分离：根据酶蛋白的密度和形状，通过离心分离。

- 层析法：根据酶蛋白的亲和性、电荷等性质，通过层析法分离。

- 沉淀法：通过改变pH、盐浓度等方法，使酶蛋白沉淀。

3. 酶的稳定化方法：- 添加稳定剂：如磷酸盐、糖类等。

- 调节pH和温度：保持酶的活性。

五、实验结果与分析1. 细胞破碎方法：- 机械破碎：适用于酶蛋白含量较高的细胞，但可能导致酶活性降低。

- 化学破碎：适用于酶蛋白含量较低的细胞，但可能引入杂质。

2. 酶的纯化方法：- 离心分离：简单易行，但纯度较低。

- 层析法：纯度较高，但操作复杂。

- 沉淀法：操作简单，但纯度较低。

3. 酶的稳定化方法：- 添加稳定剂：能提高酶的稳定性，但可能影响酶活性。

- 调节pH和温度：能保持酶的活性，但可能影响酶的稳定性。

六、实验讨论1. 酶的提取方法应根据酶蛋白的性质、含量、应用领域等因素综合考虑。

2. 提取过程中，应尽量减少酶的活性损失，提高提取效率。