互联网2 1 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
一、实验目的
学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量
一、 实验目的：
1、了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
2、学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
二、 实验原理：
SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。
1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
三、 仪器、原料和试剂
1、仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。
2、原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
3、试剂：
（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris
36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris
5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。
（4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
一、实验目的
1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。
二、实验原理
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
三、实验器材及数据
30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml
实验七 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量
实验数据：
标准蛋白质条带
第一条 第二条 第三条 第四条 第五条
溴酚蓝前沿距离/cm 4.70
距离/cm 0.50 0.95 1.60 2.10 3.95
相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84
分子量Mr 97400 66200 43000 31000 14400
LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16
样品 1 2 3
溴酚蓝前沿/cm 4.90 4.80 4.60
样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70
相对迁移率mr 0.86 0.25 0.37
标准曲线：
y=5.05-1.10x
结果：
样品 1 2 3
Mr 12706 59566 43954
mr 4.104 4.775 4.643
一. 实验目的和要求
1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2 掌握垂直板电泳的操作方法。
3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二 .实验原理
带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
