SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定方案

步骤：

（1)先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干，两边用夹子夹住，装好。

（2)琼脂的加入

将1.5%的琼脂融化，趁热用吸管吸取热的1.5%琼脂沿电泳槽的两边条内测加入电泳槽的底槽中，封住缝隙，待琼脂凝固。

（3)分离胶的灌注

将加入TEMED后制成的分离胶立即混合均匀，然后用滴管吸取分离胶，浇灌到电泳槽的量玻璃板之间，留出梳齿的齿高加上1—1.5cm的距离，高度大约达电泳槽高度的2/3左右，再用滴管小心地在其上面覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静止于室温下约30—60min,待分离胶聚合完全后，用滤纸尽可能的吸去上面的水，尽可能的干净。

（4)浓缩胶的灌注

将加入TEMED后制成的浓缩胶在试管中立即混合均匀，灌注在分离胶上，小心的插入梳尺，避免气泡，带浓缩胶凝聚完全后，将梳齿小心拔出，用电泳缓冲液立即冲洗孔格数次，待孔格凝固完全。

（5)用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样,上面加20%甘油1滴，溴酚蓝指示剂1滴，再用滴管小心加入少量电极缓冲液，使充满梳孔。

（6)电泳

将电极缓冲液分别接入上下电泳槽，接上电泳仪，上电极接负级，下电极接正极。打开电泳仪开关，调节电压至300V，电流至20—30mA，并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距离凝胶下端约1cm时，停止电泳。

（7）染色和脱色

小心将胶取出，置于一大培养皿中，在溴酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志。加染色液染色1h，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。

（8）相对分子质量的计算

用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率：

样品迁移率距离（cm）

相对迁移率=----------------------

染色迁移距离（cm）

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种蛋白质分析方法，常用于测定蛋白质的相对分子量。其原理是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电，使蛋白质在凝胶中按照相对分子量大小进行分离。

具体原理如下：

1. SDS：SDS是一种表面活性剂，它可以与蛋白质发生结合，使得所有蛋白质带有相同的电荷密度。

2. 蛋白质解不性：在SDS存在条件下，蛋白质发生解性，其中SDS会形成不溶解的复合物，使蛋白质具有均一负电荷。

3. 凝胶电泳：将SDS处理后的蛋白质样品加于聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上，施加电场使蛋白质迁移。

4. 分离：由于凝胶电泳胶阻力不同，蛋白质经过一段时间后在凝胶上分离成锥形区带。

5. 相对分子量测定：在同一凝胶中，已知相对分子量已知的标准蛋白质样品与待测蛋白质样品进行分析，通过对比标准蛋白质样品的迁移距离和待测蛋白质样品的迁移距离，可以推算出待测蛋白质样品的相对分子量。

需要注意的是，由于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是以相对分子量进行分析的，所以对于蛋白质的准确分子量测定，还需结合其他方法如质谱等进行综合分析。

sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.

实验目的：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分离蛋白质并测定分子量。

实验原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种分离蛋白质的标准方法，可对不同来源和大小的蛋白质进行分离和鉴定。在本实验中，通过将蛋白质溶解于含有SDS和2-巯基乙醇等条件下的试样缓冲液中，以使蛋白质带有几乎相同的负电荷，通过电泳使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中以大小不同的分子量在电场作用下移动，最终被染色，进行分离鉴定。

实验步骤：

1.准备实验材料：SDS-PAGE电泳装置、试样缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶、蛋白质样品、电泳缓冲液等。

2.制备SDS-PAGE电泳凝胶：按照说明书，将聚丙烯酰胺凝胶拆封并放置在实验室温度下一段时间，使其柔软。

3.制备电泳缓冲液：按照说明书，取适量的Tris、glycine和SDS等物质，配制电泳缓冲液，使其达到所需浓度。

4.制备试样缓冲液：按照说明书，取适量的Tris、SDS和2-巯基乙醇等物质，配制试样缓冲液。

5.制备样品：取适量的蛋白质样品，在试样缓冲液中煮沸一段时间，使蛋白质分子展开。

6.装样：将制备好的样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳装置样品槽中。

7.电泳：按照说明书，调整电泳缓冲液pH值和电泳电压等条件，开启电泳装置，进行电泳操作。

8.染色：将电泳板取出，进行荧光染色或银染色法。

9.图像处理：使用图像分析系统或其他软件，进行蛋白质条带的分析和图像处理。

实验结果：经过SDS-PAGE电泳后，样品中的蛋白质在凝胶中呈现出大小不同的分子量条带，通过荧光染色或银染色可以清晰地看到分离的蛋白质条带。根据蛋白质的分子量大小，可以判断样品中含有哪些蛋白质。

1．如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4克SDS/1克蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：（1）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。（2）溶液中SDS的浓度：溶液中的SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。（3）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。

2．不同的凝胶浓度适用地不同的分子量范围，Weber的实验指出，在5%的凝胶中，分子量25,000—200,000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10.000—70,000分子量的蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10,000—50,000分子量的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%）的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。

可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率，详见后）最好在0.2—0.8之间均匀分布。

在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。

3．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。