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SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量

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实验 6 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量

实验目的

学习并掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法；

掌握垂直板电泳的操作方法；

运用SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。

实验原理

1、在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。

2、在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质-SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

3、当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：

㏒10Mr = －b·mR+ K

（式中：Mr为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在条件一定时，b 和K均为常数。）

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

实验步骤

1.装板：将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上。（夹子离梳子底边约2mm）

2. 制备分离胶：在烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。

凝胶液的灌注和聚合：将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，然后加乙醇。10－15min后，待分离胶凝固，倒出乙醇。

3. 制备浓缩胶：在烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶

4. 往分离胶层上加浓缩胶，将梳子插入胶液顶部（20min）。

5. 样品处理：在1.5ml离心管中按1：1体积比加样品和上样缓冲液，100C加热3min。

6. 浓缩胶完全聚合后，将凝胶固定于电泳装置上，内、外槽各加入电极缓冲液，小心移除梳子，注意排出气泡。（注意：取下橡胶框）

7. 用移液枪依次在各个样品槽加样（20－40L）。（注意：将marker置于中间泳道）

8.电泳：

连接正、负极，打开电源，刚开始时，电压控制在120～130v左右，样品进分离胶后，缓慢升高电压至140v。保持电压强度不变。待指示剂染料靠迁移至下沿处停止电泳，需1.5小时左右。

9.剥胶染色： 项目浓缩胶的配制（6ml）

30% 丙烯酰胺（ml）1

浓缩胶缓冲液，pH6.8（ml） 1.5

H2O（ml） 3.4

10% 过硫酸铵（ml） 0.06

TEMED（μl） 8 项目 分离胶的配制（10ml）

30% 丙烯酰胺（ml） 3.4

分离胶缓冲液，pH8.8（ml） 2.4

H2O （ml） 4.1

10% 过硫酸铵（ml） 0.1

TEMED（μl） 10 电泳结束后，取下凝胶膜，卸下凝胶膜上的橡胶框，用金属片将短玻璃撬开后取出凝胶板。将剥离下来的聚丙烯酰胺凝胶用水漂洗，转入染色缸中，加染色液，置摇床染色约15min。

10.脱色：染色完毕，倾出染色液，换2～3次漂洗液，共脱色2小时左右。

11.观察：将观察分析结果（分子量、纯度）写在实验报告上。

思考题

1、用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时为什么要用巯基乙醇？

2、SDS在该电泳方法中的作用是什么？

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SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。

SDS-PAGE电泳的原理：

SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。

SDS-PAGE电泳的过程：

SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。

（1）样品加载：

样品的制备：

蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。

（2）电泳：

将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。

（3）染色：

电泳结束后，将凝胶板进行染色。目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie

Brilliant Blue染色法。

SDS-PAGE电泳的应用：

SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。

SDS—PAGE凝胶电泳(细致分析)

SDS—PAGE凝胶电泳(细致分析)

SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤

1. 名称：

SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

2. 原理：

此项技术的原理，是根据样品中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。

不同的蛋白质在不同的pH值下表现出不同的电荷，同时蛋白质具有不同的大小和形状。为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理。

上样缓冲液由Tris-HCl （pH6.8） 、甘油，10％SDS、β-巯基乙醇、0.1％溴酚蓝以及蒸馏水组成。其各自的作用如下述：

SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或者单个肽链，因此测定结果只是亚基或者单个肽链的分子量。同时，SDS与蛋白质结合引起蛋白质的构象改变，形成长椭圆棒状，不同蛋白质短轴长度都一样，长轴随蛋白分子量不同而不同，这样就消除了性状的影响。另外，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

甘油用以增大样品液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。 样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。样品液和浓缩胶中Tris-HCl均为pH6.8,上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3）,分离胶含Tris-HCl(Ph8.8).

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

一、实验目的

通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。

二、实验原理

SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。

三、实验步骤

1. 准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。

2. 制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。

3. 制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。

4. 制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。

5. 电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。打开电源，调整电流和电压，开始电泳。 6. 染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。

7. 相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。

四、结果分析

通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

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资料. SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量

一、前言

聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因

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资料. 素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。