流加发酵与高密度培养

⼤肠杆菌发酵经验总结⼤肠杆菌发酵经验总结⾸先，补料速率与⽐⽣长速率直接影响着⼄酸的⽣成速率和积累量（主要是补料速率与⽐⽣长速率影响发酵液中的残糖量，进⽽影响），所以适当的控制补料速率和⽐⽣长速率，对于控制⼄酸的量有很好的效果。

其次，必须要保证充⾜的溶氧，并严格控制pH值，⽽且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋⽩的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所⽣产出的蛋⽩⼤多是有活性的，⽽较⾼的发酵温度下产⽣的蛋⽩⼤多⼀包涵体形式存在。

第三，选取合理的诱导时间⾮常重要，⼀般的诱导时间选在指数⽣长后期，⽽且诱导时的⽐⽣长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速⽣长期与蛋⽩合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋⽩的⾼表达；2.已经得到了⼤量的菌体，⽽且菌体的⽣物量基本接近稳定，不论是从动⼒学⾓度，还是能耗，物料成本⽅⾯，都⽐较合理。

第四，补料过程中的碳氮⽐也很重要。

若氮源过⾼，会使菌体⽣长过于旺盛，pH偏⾼，不利于代谢产物的积累，氮源不⾜，则菌体繁殖量少从⽽影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体⽣长，碳源不⾜，则容易引起菌体的衰⽼和⾃溶。

另外，碳氮⽐不当还会引起菌体按⽐例的吸收营养物质，从⽽直接影响菌体的⽣长和产物的合成。

根据⾃⼰的经验，⼀般情况下，对于⼀个稳定的发酵⼯艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，⽽且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮⽐不合理造成的。

可以适当调整碳氮⽐。

⼤家讨论得较多的是关于代谢副产物⼄酸对⼤肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下⼏点，并作出相应解决措施。

⼀、代谢副产物-⼄酸⼄酸是⼤肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多⼤的浓度下产⽣抑制作⽤各种说法不⼀，⼀般认为在好⽓性条件下，5～10g/L 的⼄酸浓度就能对滞后期、最⼤⽐⽣长速率、菌体浓度以及最后蛋⽩收率等都产⽣可观测到的抑制作⽤。

当⼄酸浓度⼤于10或20g/L 时，细胞将会停⽌⽣长，当培养液中⼄酸浓度⼤于12g/L 后外源蛋⽩的表达完全被抑制。

微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。

一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。

但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。

Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。

而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。

高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。

随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。

基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。

其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。

底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。

呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。

高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。

一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。

培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。

高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。

一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法酿酒酵母是一种重要的微生物资源，广泛应用于酿造行业。

高密度发酵培养是提高酿酒酵母生产效率的关键技术之一。

本文将介绍一种高密度发酵酿酒酵母的培养方法。

首先，酿酒酵母的培养基是高密度发酵的关键。

传统的酵母培养基主要由碳源、氮源、无机盐和微量元素组成。

在高密度发酵中，碳源的选择对提高酵母生长速度和酒精产生率很重要。

常用的碳源有葡萄糖、麦芽糖和淀粉等。

氮源是合成蛋白质和酵母细胞增殖的关键，常用的氮源有尿素、酵母浸渍物和氨态氮等。

在培养基中添加适量的无机盐和微量元素可以提供必需的元素，维持酵母细胞的正常生长和代谢活动。

其次，培养条件的调控对高密度发酵效果也有影响。

温度是控制酵母生长速率和代谢的重要因素，一般酿酒酵母的适宜培养温度为28-32摄氏度。

pH值是影响酵母生长和酒精产生的重要因素，常规条件下酵母培养基的pH值在4.5-5.5之间。

通风条件也是高密度发酵的重要指标，合理的通风条件有利于提供足够的氧气，促进酵母的代谢活动。

此外，酿酒酵母的菌种的选取也是高密度发酵成功的关键。

目前常用的菌种包括酒链球菌、面包酵母等。

选取适宜的菌株是提高高密度发酵效率的前提，菌株应具有良好的生长能力和耐受性，能够在高浓度的酒精环境中生存和繁殖。

最后，监控和调控发酵过程对高密度发酵的成功也至关重要。

通过监测酵母生长曲线、酒精产量和其它重要的发酵参数，可以及时发现并纠正发酵过程中的问题，提高发酵效果。

在发酵过程中，定期采集发酵液进行物理化学分析和微生物检验，以确保发酵过程的有效控制。

综上所述，高密度发酵是提高酿酒酵母生产效率的重要手段之一。

通过优化培养基组成、调控培养条件、选用合适的菌株以及监控和调控发酵过程，可以取得较高的发酵效果。

酒精工业可以借鉴这些方法，提高酿酒酵母的生产效率，推动酒精工业的可持续发展。

流加培养名词解释-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述流加培养作为生物学和微生物学领域的一种培养方法，是一种通过提供适当的培养基和环境条件来满足细胞或微生物生长和繁殖的需求的过程。

它是一种广泛应用于实验室和工业生产中的技术，对于研究生物学和微生物学以及制造生物制品具有重要意义。

流加培养的基本原理是通过向培养基中连续添加新的培养液来维持细胞或微生物的生长。

在流加培养中，培养液会通过一个进料管源源不断地被加入到培养基中，而废液则通过排液管定期排除。

这种持续供给新鲜培养液和同时排除废液的过程，使得培养物中的养分始终处于较高的浓度，同时也有效地去除了代谢产物和有害物质，为细胞或微生物的生长提供了一个良好的环境。

流加培养广泛应用于许多领域，包括生物技术、生物制药和科学研究等。

在生物技术领域，流加培养被用于生产重组蛋白、表达目的蛋白以及制造生物燃料等。

在生物制药领域，流加培养可以用于生产抗生素、疫苗和其他生物制剂。

在科学研究中，流加培养被用于研究细胞生长和发育、细胞代谢以及微生物的生理学等。

尽管流加培养在许多方面具有优势，但也存在一些缺点。

流加培养的设备和操作相对复杂，需要一定的技术支持和成本投入。

此外，对于某些细胞或微生物来说，流加培养可能无法提供最适宜的生长环境。

因此，在选择培养方法时，需要根据具体的需求和实际情况进行权衡和选择。

综上所述，流加培养作为一种常用的生物学和微生物学培养方法，在实验室和工业中具有广泛的应用。

通过提供连续的培养液供给和废液排除，流加培养为细胞和微生物的生长提供了一个稳定和良好的环境。

然而，在实际应用中也需要考虑到其设备复杂性和适用性。

1.2文章结构文章结构部分内容：在本文中，我将按照以下结构来组织和呈现关于流加培养的相关内容。

首先，在引言部分，我会对流加培养进行概述，介绍其基本概念和背景。

接着，我会详细阐述本文的结构，包括各个章节的内容和组织方式。

最后，我会明确阐明本文的目的和意图。

大规模培育技术应用简介通过大规模体外培育技术培育哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。

20 世界 60-70年月，就已创立了可用于大规模培育动物细胞的微载体培育系统和中空纤维细胞培育技术。

近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织猎取生物制品已远远不能满足这一需求。

随着细胞培育的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培育技术趋于成熟。

所谓动物细胞大规模培育技术〔large-scale culture technology〕是指在人工条件下〔设定ph、温度、溶氧等〕，在细胞生物反响器〔bioreactor〕中高密度大量培育动物细胞用于生产生物制品的技术。

目前可大规模培育的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho〔中华仓鼠卵巢〕细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依靠的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。

在过去几十年来，该技术经有了很大进展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培育，进展为生物反响器〔Bioreactor〕进展大规模细胞培育。

第一代细胞培育技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产简洁导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进展生产和质量控制。

随着生物技术的进展，迫切需要大规模的细胞培育，特别是培育表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。

承受玻璃瓶静置或旋转瓶的培育方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。

因而必需为工业化生产开创一种的技术方法。

自 70 年月以来，细胞培育用生物反响器有很大的进展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培育生物反响器有空气提升反响器，中空纤维管反响器，无泡搅拌反响器及篮式生物反响器等。

1、何谓流加发酵？答：所谓流加发酵，即补料分批发酵(Fed-batch fermentation)，有时又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法2、写出Monod 方程，并写出其成立的条件和各参数的意义。

答： 条件：温度和pH 恒定时(1)菌体生长为均衡型非结构生长；(2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物；(3)菌体产率系数恒定参数意义：μmax 称为最大比生长速率(h-1)，Ks 称为半饱和常数(g/L),S 为限制性底物浓度。

3、细胞高密度培养过程存在的问题有哪些？其相应解决措施有哪些？答：问题：1.产物或代谢副产物的积累对生长的抑制2.氧的限制3.HCDC 中培养基粘度不断增加，引起混合不充分4.CO2和热量的高释放率解决措施1.控制比生长速率在产生乙酸的临界值以下选择合适的培养基2提高通气速率和搅拌速度富氧空气和纯氧在加压环境下培养 SK S s +=max μμ3有必要研究发酵罐中的搅拌模型，找到改善搅拌的方法。

4通过降低细胞比生长速率而部分的解决把培养温度从37℃降到26－30℃，会降低营养吸收和生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。

降低温度也能减少细胞对氧的需求。

降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质的产生。

4、无反馈控制的流加策略有哪些？答：开环（无反馈）控制恒速流加——以预先决定的（恒定的）速率流加营养物质，比生长速率逐渐降低。

加速流加——以逐渐增加的速率流加营养物质。

可补偿一些比生长速率的降低。

指数流加——以指数的速率流加营养物质。

可得到恒定的比生长速率。

闭环（反馈）控制即时DO——当DO降低时补加营养物质。

即时pH——主要碳源耗尽引起pH上升时补加营养物质。

二氧化碳释放率（CER）——CER基本正比于碳源的消耗速度。

这一方法最为经常用于控制比生长速率。

细胞浓度——营养物质流加速率由细胞浓度决定。

底物浓度控制——营养物质流加速率直接由主要碳源的浓度控制5、何谓发酵产物的理论得率？可由哪些途径计算得到？答：假设发酵过程中完全没有菌体生成，则YP/S 可达理论最高值，称为理论代谢产物产率 计算途径（a ）根据化学计量关系计算例如，由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化学计量方程为∶依此计算 =147/180=0.82 （b ）由生物化学计量关系计算根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径，进行代谢过程中有关NAD(P)+和ATP 等辅底物的物料衡算，结合化学计量关系可求出下式 由该反应式得 =(147×12)/(13×180)=0.75由于NADPH 和ADP 的再生过程要消耗底物，故依这种方法求得的值要小于单纯依据化学计量关系求得的结果。