DOI ：10．3724/SP．J．1096．2013．20555
超高效液相色谱-飞行时间质谱法高通量筛查乳制品中20种镇静剂
严丽娟
1
张洁
*2
潘晨松
3
林立毅
1
张欣怡
3
申河清
2
1
（厦门出入境检验检疫局，厦门361012）
2
（中国科学院城市环境研究所城市环境与健康重点实验室，厦门，
361021）3
（美国布鲁克道尔顿公司北京代表处，北京100081）
摘要利用超高效液相色谱/高分辨飞行时间质谱，结合数据库，建立了乳制品中20种镇静剂的高通量筛
查方法。样品以乙腈和酸化乙腈沉淀蛋白质和脂肪，冷冻离心浓缩，经超高效液相色谱分离，采用电喷雾离子源，正离子模式，基质匹配法进行定量分析，可在9min 内对20种镇静剂进行高通量筛查和定量分析。镇静剂的质量浓度在1 500"g /L 或5 1000"g /L 范围内具有较好的线性关系，检出限为0．3 1．5"g /L ，定量限为1 5"g /L 。在5和50"g /L 添加水平时，平均回收率为76．1% 108．2%，相对标准偏差为2．5% 9．0%。利用TargetAnalysis 软件建立镇静剂数据库，并应用于加标样品的筛查分析。通过数据库比对，样品中添加的镇静剂被全部筛查出来，鉴定准确度达到了100%，保留时间偏差小于0．1min ，质量偏差小于3mDa ，同位素峰形匹配度大于89．5%。利用本方法对购自超市的8个不同品牌的50余份乳制品进行了筛查分析，均未检出阳性样品。关键词
镇静剂；乳制品；超高效液相色谱；飞行时间质谱；高通量筛查
2012-06-01收稿；2012-09-21接受
本文系质检公益性行业科研专项课题（No．200910145）和厦门市科技项目（Nos．3502Z20112017，
3502Z20092009）资助*E-mail ：jzhang@iue．ac．cn
1引言
食品中兽药残留检测已从单一化合物发展为多种不同化合物的同时定性和定量分析。与低分辨的
三重四级杆质谱不同，高分辨飞行时间质谱（High resolution time-of-flight mass spectrometer ，HRTOF-MS ）能够采集高质量分辨率和高准确度的全扫描数据，目标化合物数目没有任何限制。利用精确分子量和同位素峰形还可对异常未知峰进行准确的定性分析。研究人员已经利用该技术建立了蔬菜、水果、肉制品中有害物质的同时检测方法［1 7］
，显示了其在高通量筛查应用中的巨大潜力，但是国内该方面相
关的报道还较少。
镇静剂药物具有抑制躁狂、镇吐等作用，可能被添加到奶牛饲料中以促进采食，提高饲料转化率，并缓解奶牛热应激，提高产奶量［8］
。但是，这类药物的残留会造成过敏、心悸、肝损害等不良反应。农业部第176号公告中明确禁止在动物饲料和饮用水中添加氯丙嗪、异丙嗪、地西泮、利血平等镇静剂
［9］
。
国标GB /T22993-2008也制定了乳制品中氯丙嗪和氟哌啶醇等8种镇静剂的检测方法［10］。鉴于我国食品安全的现状，有必要对更多镇静剂进行监测。本研究以氯丙嗪、氟哌啶醇、地西泮和艾司唑仑等20种镇静剂为例，发展了基于超高效液相色谱-飞行时间质谱技术，结合筛查数据库的高通量分析方法，成功应用于乳制品的快速筛查，方法检出限等技术指标满足相关法规要求。
2
实验部分
2．1
仪器与试剂
超高效液相色谱（美国Waters 公司）；四极杆/飞行时间质谱（美国Bruker 公司）；Speedvac 离心浓缩仪（美国Thermo 公司）；高速离心机（德国Hettich 公司）。
氯丙嗪、氟哌啶醇、地西泮和艾司唑仑等20种镇静剂标准品（纯度＞98%），购自美国Cerilliant 公
第41卷2013年1月
分析化学（FENXI HUAXUE ）研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry
第1期31 35
司和德国Dr．Ehrenstorfer 公司；甲酸（纯度为99%，美国Acros Organics 公司）；乙腈、甲醇（HPLC 级，美国Merck 公司）。2．2
样品前处理
准确移取2mL 液态奶于离心管中，加入2mL 乙腈，旋涡振荡提取1min ，
8000g 离心5min ；将上层清液全部转移至新离心管中，加入6mL 酸化乙腈（0．2%甲酸，V /V ），旋涡振荡1min ，
8000g 离心5min ；小心吸取5mL 上层清液至15mL 离心管；浓缩至溶液体积小于1mL ，全部转移到1．5mL 离心管中继续浓缩至近干；加入0．3mL 30%乙腈溶液溶解提取物，经过0．22"m 滤膜过滤，转移到装有内插管的样品瓶中，分析前置于!20?保存。对于奶粉等固体样品，准确称取0．6g 粉末样品，加入2mL 超纯水充分溶解，其它处理步骤同液态奶。2．3超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱的分析条件Waters ACQUITY BEH 色谱柱（100mm ?2．1mm i．d．，1．7"m ）。流动相A 为0．1%（V /V ）甲酸溶
液，流动相B 为0．1%（V /V ）甲酸-乙腈溶液。梯度洗脱：0 2min ，30%B ；2 9min ，30% 72%B 。流速：0．30mL /min ；柱温：30?；进样器温度4?；进样体积：1"L 。电喷雾离子源（ESI ）；正离子模扫描模
式；毛细管电压：4．5kV ；雾化气：150kPa ；干燥气温度：180?；干燥气流速：6L /min ；采集质量数范围m /z 50 1000。三氟乙酸钠溶液作为外标以校正分子量。
3
结果与讨论
3．1
样品前处理条件优化
本研究采用乙腈和酸化乙腈沉淀蛋白质和脂肪，并结合高速离心，有效去除了乳制品中大量蛋白质
和脂肪，大多数镇静剂的提取率可达到80%以上。固相萃取柱常被用于进一步去除基质的干扰［2］
，本研究通过对比发现，对于这20种镇静剂，虽然在不经固相萃取柱净化的情况下存在一定的基质干扰，但是高分辨飞行时间质谱完全可以实现待测物和干扰物的区分，而且采用基质匹配法拟合标准曲线也可在一定程度上消除基质干扰。经过和不经过固相萃取柱净化的两种方法的定量准确度基本相当，并无明显差异。3．2
超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱条件的优化
考察了5mmol /L 甲酸胺-甲醇、5mmol /L 甲酸胺-乙腈、0．1%甲酸-甲醇和0．1%甲酸-乙腈4种流
动相对镇静剂离子化效率和峰形的影响。甲酸胺体系可以获得较低的背景值，
但是分析物的信号也较低，严重影响了检测灵敏度。采用甲酸体系时，虽然背景值有所升高，但是分析物的信号显著增强，信噪
比比甲酸胺体系提高了5 20倍。与甲醇相比，采用乙腈作为流动相时可以获得更好的峰形，信号响应值也略高。因此，本研究采用0．1%甲酸-乙腈作为流动相，20种镇静剂在9min 内可得到较好地分离（图1）
。
图120种镇静剂的高分辨提取离子流图
Fig．1
High resolution extracted ion chromatograms （hrEIC ，?0．003Da ）of twenty tranquilizers
峰号同表1（The peak numbers are the same as in Table 1）。
2
3分析化学第41卷
3．3精密度、线性关系和回收率
在基于UPLC /HRTOF-MS 的高通量筛查研究中，保留时间的重现性和质量准确度是定性分析的关
键参数。加标样品重复进样5次，保留时间偏差均小于0．1min ，测定分子量偏差均小于3mDa 。测定分子量偏差越小，数据处理时可设置更窄的提取离子窗口，从而可更有效排除干扰化合物，实现更准确的定性分析。另外，
高质量准确度使得在无标样情况下对未知物定性成为可能，特别是针对镇静剂这类分子量较小的化合物。例如，某化合物的实测分子量为388．1591，与氟西泮的理论分子量（388．1586）的偏差仅为0．5mDa ，而且同位素峰形匹配度为98．6%，依据这些信息即可将该化合物定性为氟西泮。
为了最大限度消除基质效应干扰，本研究采用基质匹配法进行定量分析。以空白牛奶样品的提取液配制0．1 1000"g /L 系列混合标准溶液。镇静剂（除唑吡旦外）的质量浓度在1 500"g /L 或5 1000"g /L 范围内具有较好的线性关系，检出限为0．3 1．5"g /L ，定量限为1 5"g /L （表1）。在5和50"g /L 两个添加水平测定方法回收率及精密度，平均回收率为76．1% 108．2%，相对标准偏差为2．5% 9．0%。
最优条件下的20种镇静剂的离子流谱图如图1所示。
表120种镇静剂的线性方程、相关系数、检出限和定量限
Table 1Linear equations ，correlation coefficients ，limits of detection （LOD ）and limits of quantification （LOQ ）of twenty tranquilizers
序号No．名称Name
分子式Formula 线性范围Linear range （"g /L ）线性方程Linear equation 相关系数Correlation coefficient 检出限LOD （"g /L ）1唑吡旦Zolpidem
C 19H 21N 3O 1 100Y =894．34X －3085．21
0．99920．32利眠宁Chlordiazepoxide C 16H 14ClN 3O 1 500Y =61．04X +838．940．99040．33氯氮平Clozapine C 18H 19ClN 45 1000Y =420．18X +2832．05
0．99591．54咪达唑仑Midazolam C 18H 13ClFN 31 500Y =363．10X －1075．36
0．99980．35氟西泮Flurazepam C 21H 23ClFN 3O 1 500Y =374．79X +1205．98
0．9980．36氟哌啶醇Haloperidol C 21H 23ClFNO 21 500Y =495．46X －1511．77
0．99750．37硝西泮Nitrazepam
C 15H 11N 3O 35 1000Y =244．68X +1849．94
0．99961．58氟硝西泮Flunitrazepam C 16H 12FN 3O 35 1000Y =243．04X +7354．75
0．99721．59异丙嗪Promethazine C 17H 20N 2S 1 500Y =52．24X －348．650．99880．310艾司唑仑Estazolam C 16H 11ClN 45 1000Y =187．54X +483．72
0．99991．511安眠酮Methaqualone C 16H 14N 2O 5 1000Y =577．52X +4384．88
0．99981．512诺氟西汀Norfluoxetine C 16H 16F 3NO 5 1000Y =24．00X +2835．29
0．98371．513奥沙西泮Oxazepam C 15H 11ClN 2O 25 1000Y =51．71X +83．230．99971．514阿普唑仑Alprazolam C 17H 13ClN 45 1000Y =286．22X －23．770．99991．515利血平Reserpine C 33H 40N 2O 91 500Y =250．35X －4638．62
0．99960．316三唑仑Triazolam C 17H 12Cl 2N 45 1000Y =292．60X －764．03
0．99961．517氯丙嗪Chlorpromazine C 17H 19ClN 2S 1 500Y =341．20X +821．06
0．99530．318替马西泮Temazepam C 16H 13ClN 2O 25 1000Y =68．78X +524．190．99941．519甲硫达嗪Thioridazine C 21H 26N 2S 21 500Y =775．97X +3558．79
0．99320．520
地西泮Diazepam
C 16H 13ClN 2O
5 1000
Y =619．82X +1841．88
0．999
1．5
国标GB /T22993-2008中氯丙嗪和氟哌啶醇的检出限分别为0．5和0．1"g /L ，而本研究中这两种镇静剂的检出限均为0．3"g /L ，与国标相当。由于我国目前尚未对乳制品中镇静剂制定限量标准，本研究参考了日本肯定列表的一律标准。本方法中镇静剂的检出限均低于一律标准的限量值（10"g /L ）。因此，本方法完全能够满足日常检测的需要。3．4
数据库的建立及筛查
利用TargetAnalysis 软件建立筛查数据库，包含镇静剂的保留时间、精确分子量、同位素峰形等信息。保留时间和精确分子量在鉴定过程中起主要作用，如果两个化合物保留时间和精确分子量（质谱测定偏差范围内）非常接近，就必须依靠同位素峰形匹配度进行进一步的确认。利用筛查数据库对某随机加标样品进行了测试，结果如表2所示，保留时间偏差小于0．1min ，质量偏差小于3mDa ，同位素峰形匹配度大于89．5%，通过比对保留时间、精确分子量、同位素峰形匹配度等信息即可实现快速、准
3
3第1期严丽娟等：超高效液相色谱-飞行时间质谱法高通量筛查乳制品中20种镇静剂
确的筛查，准确度达到100%。
3．5实际样品的测定
利用本方法对购自超市的8个不同品牌的50余份乳制品进行了筛查分析，均未检出上述20种镇静剂。表2TargetAnalysis筛查结果
Table2Screening result from TargetAnalysis software
评分Score 名称
Name
理论质量数
Theoretical
mass
（Da）
实测质量数
Measured
mass
（Da）
质量数偏差
Deviation of
mass
（mDa）
保留时间偏差
Deviation of
retention time
（min）
同位素峰形匹配度
Degree of isotope
pattern match
（%）
+++唑吡旦Zolpidem308．1757308．1759!0．10．098．7
+++利眠宁Chlordiazepoxide300．0898300．0913!1．50．092．3
+++氯氮平Clozapine327．1371327．13670．40．098．0
+++咪达唑仑Midazolam326．0855326．0857!0．20．098．1
+++氟西泮Flurazepam388．1586388．1591!0．5!0．198．6
+++氟哌啶醇Haloperidol376．1474376．14601．40．096．0
++异丙嗪Promethazine285．1420285．13942．6!0．189．5
+++硝西泮Nitrazepam282．0873282．08680．60．098．8
+++氟硝西泮Flunitrazepam314．0935314．0945!1．0!0．199．6
+++艾司唑仑Estazolam295．0745295．07420．3!0．196．2
+++安眠酮Methaqualone251．1179251．1186!0．70．098．7
+++诺氟西汀Norfluoxetine296．1257296．12461．1!0．196．9
+++奥沙西泮Oxazepam287．0582287．0586!0．4!0．191．3
+++阿普唑仑Alprazolam309．0902309．0903!0．10．097．9
+++利血平Reserpine609．2807609．27980．80．097．3
+++三唑仑Triazolam343．0521343．05110．10．091．1
+++氯丙嗪Chlorpromazine319．1030319．10280．20．097．5
++替马西泮Temazepam301．0738301．0766!2．80．092．7
+++甲硫达嗪Thioridazine371．1610371．1614!0．40．098．2
+++地西泮Diazepam285．0789285．0792!0．30．097．7
评分标准：+++保留时间偏差≤0．1min，质量偏差≤2mDa，同位素峰形匹配度≥90%；++保留时间偏差≤0．5min，质量偏差≤
5mDa，同位素峰形匹配度≥85%。
Score standards：+++Deviation of retention time≤0．1min，deviation of mass≤2mDa，degree of isotope pattern match≥90%；++ Deviation of retention time≤0．5min，deviation of mass≤5mDa，degree of isotope pattern match≥85%．
3．6结论
基于UPLC/HRTOF-MS技术，结合数据库，建立了高通量筛查20种镇静剂的方法，采用基质匹配进行定量分析，并应用于市售乳制品中20种镇静剂的快速筛查分析。HRTOF-MS能够提取扫描范围内所有目标化合物的精确质量色谱图，理论上增加新的目标化合物不会降低方法的灵敏度，而且全扫描数据还可以随时进行重新处理。本研究组将进一步扩充数据库，以实现对乳制品等食品中更多兽药残留的高通量筛查。
References
1Valverde A，Aguilera A，Ferrer C，Camacho F，Cammarano A．J．Agric．Food Chem．，2010，58（5）：2818－2823
2Stolker A A，Rutgers P，Oosterink E，Lasaroms J J，Peters R J，Van Rhijn J A，Nielen M W．Anal．Bioanal．Chem．，2008，391（6）：2309－2322
3Deng X J，Yang H Q，Li J Z，Song Y，Guo D H，Luo Y，Du X N，Bo T．J．Liquid Chromatogr．Related Technol．，2011，34：2286－2303
4Hayward D G，Wong J W，Zhang K，Chang J，Shi F，Banerjee K，Yang P．J．AOAC．Int．，2011，94（6）：1741－1751 5WANG He-Xing，ZHOU Ying，JIANG Qing-Wu．Chinese J．Anal．Chem．，2011，39（9）：1323－1328王和兴，周颖，姜庆五．分析化学，2011，39（9）：1323－1328
6ZHANG Feng，DING Fei，CHU Xiao-Gang，LI Fan-Zhu，YONG Wei，WANG Xiu-Juan，L Quan-Fu，XU Cheng-Bao．Chinese J．Anal．Chem．，2011，39（6）：788－792
张峰，丁菲，储晓刚，李范珠，雍炜，王秀娟，吕泉福，许成保．分析化学，2011，39（6）：788－792
43分析化学第41卷
7
SUN Bi-Xia ，GUO De-Hua ，DING Zhuo-Ping ，JI Feng ，DONG Ji-Chuan ，YAO Jin-Ting．J．Instrumental Anal．，2010，29（10）：1017－1024
孙碧霞，郭德华，丁卓平，冀峰，董吉川，姚劲挺．分析测试学报，
2010，29（10）：1017－10248LI Zhen．Guangdong Diary Prod．，2009，2：25－27李振．广东奶业，
2009，2：25－279
Ministry of Agriculture．No．176Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People's Republic of China ，http ：//www．moa．gov．cn /zwllm /tzgg /gg /201104/t20110422_1976307．htm ，
2002农业部，中华人民共和国农业部公告第176号，http ：//www．moa．gov．cn /zwllm /tzgg /gg /201104/t20110422_1976307．htm ，
200210GB /T 22993-2008，Determination of Eight Tranquillizers Residues in Bovine Milk and Milk Powder-LC-MS-MS Method．National Standards of the People's Republic of China
牛奶和奶粉中8种镇定剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法．中华人民共和国国家标准．GB /T 22993-
2008High Throughput Screening of Tranquilizers in Dairy Products
Using Ultra Performance Liquid Chromatography Coupled to
High Resolution Time-of-Flight Mass Spectrometry
YAN Li-Juan 1，ZHANG Jie *2，PAN Chen-Song 3，LIN Li-Yi 1，ZHANG Xin-Yi 3，SHEN He-Qing 2
1
（Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ，Xiamen 361012，China ）
2
（China Key Laboratory of Urban Environment and Health ，Institute of Urban Environment ，
Chinese Academy of Sciences ，Xiamen 361021，China ）
3
（Bruker Daltonics Beijing Office ，Beijing 100081，China ）
Abstract A high throughput screening method was developed for the simultaneous determination of twenty
representative tranquilizers in dairy products using the combination of ultra-performance liquid chromatography-high resolution time-of-flight mass spectrometry and screening database built with Target Analysis software．The protein and fat in the sample was removed using a two-step precipitation of acetonitrile and acidic acetonitrile ，and the supernatant was combined and concentrated with Speedvac concentrator．
The
chromatographic separation was performed on an ACQUITY BEH column with gradient elutin using 0．1%formic acid and acetonitrile as mobile phase at a flow rate of 0．3mL /min．The monitoring of tranquilizers was achieved by time-of-flight mass spectrometry under positive ionization mode in 9min．The quantification was performed with matrix-matching method．The linear ranges were 1－500"g /L or 5－1000"g /L．The LODs
and LOQs were 0．3－1．5"g /L and 1－5"g /L ，respectively．At 5and 50"g /L spiked levels ，the average recoveries were 76．1%－108．2%with relative standard deviations of 2．5%－9．0%．The screening result for spiked sample showed all the spiked tranquilizers could be correctly identified with low deviations of retention time （＜0．1min ）and mass （＜3mDa ）and high degrees of isotope pattern match （＞89．5%）．The developed method was further applied for the analysis of 50real dairy products ，and no positive sample was detected．Keywords
Tranquilizer ；Dairy product ；Ultra performance liquid chromatography ；Time-of-flight mass
spectrometry ；High throughput screening
（Received 1June 2012；accepted 21September 2012）
5
3第1期严丽娟等：超高效液相色谱-飞行时间质谱法高通量筛查乳制品中20种镇静剂
国家计量技术规范规程制修订 《飞行时间质谱仪校准规范》 （报批稿） 编写说明 中国计量科学研究院 广东省计量科学研究院 南京市计量监督检测院 2013年5月
《飞行时间质谱仪校准规范》（报批稿） 编写说明 一、任务来源 根据国家质量监督检验检疫总局2009年国家计量技术法规计划（国质检量函〔2009〕393号）立项，由中国计量科学研究院、广东省计量科学研究院和南京市计量监督检测院共同承担《飞行时间质谱仪校准规范》的制定工作。 二、规范制定的必要性 飞行时间质谱仪是一种高分辨质谱仪，这类仪器的质量分析器是一个离子漂移管。由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器。离子质量越大，到达接收器所用时间越长，离子质量越小，到达接收器所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子按质荷比的大小进行分离。与高端的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪、离子阱静电场轨道阱质谱仪相比，飞行时间质谱仪具有可检测的分子量范围大，扫描速度快，仪器结构简单，价格便宜等优势。近年来随着蛋白质组学和代谢组学的发展，各实验室飞行时间质谱仪的数量迅速增加，这些仪器除了被用于基础科研外，还被广泛地用于样品检测。据不完全统计，各个检测和校准实验室每年使用飞行时间质谱仪出具的报告数量达到1000份以上。根据《ISO/IEC 17025:2005 检测和校准实验室能力的通用要求》，检测校准实验中使用的分析设备都应当经过检定或校准，以保证仪器的准确性和测定结果的可溯源性，从而保证各个检测和校准实验室在不同时间、不同地点测定结果的准确、可比。飞行时间质谱仪由于没有检定规程或者校准规范，无法对仪器进行检定校准，已经成为当前实验室认可工作中的瓶颈之一。通过制定飞行时间质谱仪校准规范，实现仪器的校准，可以保证我国飞行时间质谱仪出具检测报告的准确有效，保护人民大众的健康，保证国际贸易的公平。 三、《飞行时间质谱仪校准规范》的制定过程 1、2008年4月28日，起草小组向主要飞行时间质谱仪生产厂家安捷伦、沃特斯、布鲁克、AB和岛津公司发函，要求其提供各自生产的各种型号的飞行时间质谱仪的质量数范围、质量准确度、信噪比、分辨力、质量数漂移、校准品等信息，作为规范制定时的参考。随后，各个厂家相继返回相应信息。
安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的：明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作，确保数据的准确性。 2. 范围：适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责：检验人员对此负责。 4.操作规程： 系统组成 本系统由1个溶剂二元输送泵（分主/A泵和副/B泵）、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。 准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的μm滤膜过滤，超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常 将待测样品按要求前处理，准备HPLC 所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。 开机： 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后，双击[Instrument 1 Online]图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏]，[ 显示状态工具栏]，[系统视图],[样品视图]，使其命令前有[√]标志，来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。
4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标，点击[设置泵…]选项，进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速：5ml/min，点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[启动]，点击[确定] ，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[关闭]，点击[确定]关泵，关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标，点击[设置泵…选项]，设流速：min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击[确定]。 数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法：从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项，如下图所示选中除[数据分析]外的三项，点击[确定]，进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息（如：测试方法）。 4.4.2.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min，在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同]，使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区 域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省
高效液相色谱质谱联用技术的应用 高效液相色谱(HPLC或LC)是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作，可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，是理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。串联质谱（MS/MS）是将一个质量选择的操作接到另一个质量选择的后面，在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多极裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量等。［1］ 高效液相色谱一质谱(HPLC—MS)联用技术是近几年来发展起来的一项新的分离分析技术，将HPLC 对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、环境分析等许多领域得到了广泛的应用。［2］ 本文着重讲述液相色谱质谱联用仪在药物分析、环境分析上的应用。 1液相色谱质谱联用在药学分析上的应用 1.1LC/MS在药物代谢中的应用 Lee等［3］总结了利用LC／MS鉴定药物代谢产物的方法，主要包括以下几个步骤：测定原形药物的质谱；选择准分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行多级质谱分析；选择原形药物的主要中性丢失，测定生物样品的中性丢失谱，图谱中的离子即为原形药物和可能的代谢物的分子离子；选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱，所得母离子即为各个代谢物；测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱，解谱得到代谢物的结构。 王宁生等［4］以LC／MS联用技术及标准品对照法，分离检测健康志愿者口服复方丹参滴丸后，血清中水溶性成分及代谢产物，从一级质谱的分子离子峰推测，丹参素及原儿茶醛在体内分别与硫酸及葡萄糖醛酸结合，产生丹参素硫酸结合物及原儿茶醛的葡糖醛酸结合物。 Hsiu SL等［5］研究芍药苷在小鼠体内药代动力学，用LC／MS方法检测体内药物浓度，未检测到芍药苷原形药物；但在血浆及各种排泄物中，均可检测其代谢物，经液相色谱一质谱分析，结合核磁共振(NMR)，确定其为芍药苷的脱糖基代谢物，提示芍药苷给药后，在肠道经细菌转化为PG后，被吸收进入血液循环中发挥作用。 Chen SJ等［6］用LC／DAD／MS／MS联用技术，对山豆根碱在小鼠体内的代谢进行了研究，用ESI ／MSn技术检测山豆根碱的代谢物，并鉴定其主要代谢物为N一去甲基山豆根碱。 1.2LC/MS在药学浓度上的应用 M．Brolis等［7］采用I-IPLC—DAD—MS法从贯叶金丝桃Hyoericum performm中分离鉴定出槲皮素、异槲皮素、金丝桃苷等成分。 Gerthard Brillgma等［8］采用HPLC—NMR和HPLC—ESI—MS—MS法对Habropetalum dawei进行分析，分离鉴定出dioneopeltine、N-methyldioncophylline、N-methyl-7-epi-dioncophylline、tetralone、(1R，3R)和(1S，3R)-N-formyl-8-hydroxy-6-methoxy-l,3-dimthyltetra-hydroisoquinoline等7个已知化合物，以及5’-O-methydioncopeltine、isoquinoline phylline 2个新化合物。 徐智秀等［9］以反相高效液相色谱法分离了9种人参皂苷（I）, 利用三级四级杆质谱研究了9种I的一级质谱（主要给出相对分子质量信息）和二级质谱（提供碎片结构信息），通过它们的质谱图差异对其进行了鉴别, 并将方法用于实际样品中的9种I的定性。 郭继芬等［10］选用Discovery C18柱，以甲醇-水-甲酸(40:60:0.025)为流动相，经紫外检测后，在ESI- 扫描方式下，对HPLC—UV图谱中各色谱峰进行一级和二级质谱分析，与对照品比较鉴定了提取物中4个已知的黄酮类化合物，推断出3个未知黄酮苷类化合物可能的结构。 2液相色谱质谱联用在环境分析上的应用 1
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 高效液相色谱质谱联用HPLC .液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索一、实验目的1、了解 LC-MS 的主要构造和基本原理； 2、学习 LC-MS 的基本操作方法； 3、掌握 LC-MS 的六种操作模式的特点及应用。 二、实验原理 1、液质基本原理及模式介绍液相色谱 - 质谱法（ Liquid Chromatography/Mass Spectrometry ， LCMS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。 但是，LC 是液相分离技术，而 MS 是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。 LC-MS 经过了约 30 年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。 现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。 质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。 （一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是 1/ 13
岛津液相色谱仪使用注意事项 1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。 11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 液相色谱柱使用经验谈 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理： a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
2015 年版药典高效液相色谱法、质谱法
2015 版药典 --- 高效液相色谱法、质谱法 0512 高效液相色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处 理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为 3.9 ～ 4.6mm，填充剂粒径为 3～lOμm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约 2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物 等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰 基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残 留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当 提高色谱柱的温度，但一般不宜超过 60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相 pH 值一般应在 2～8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚 合物色谱柱可耐受更广泛 pH值的流动相，适合于 pH 值小于 2 或大于 8 的流动相。 （2）检测器最常用的检测器为紫外 - 可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、 蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外- 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与 其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射 检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外 - 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈 线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外 - 可见分光检测器所用流动相应符合紫外 - 可见分光光度法（通则 0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测 器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇 - 水系统和乙腈 - 水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈 - 水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动 相中有机溶剂一般不低于 5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。
液相色谱-四极杆/飞行时间质谱联用（HPLC-QTOF） 一、开机 1.打开计算机，LAN Switch电源。 2.打开液相各个模块电源，打开质谱前面的电源开关，等待大约两分钟，当听到第二声溶剂阀切换的声音(表明质谱自检完成)后，仪器可以联机。 3.在计算机桌面上双击MassHunter采集软件图标，进入MassHunter工作站。 4.如果MassHunter工作站在之前曾经打开和关闭过，请确认在再次打开工作站之前，关闭MassHunter所有的进程；双击桌面上的图标，在弹出的窗口点击Shut Down，等待所有的Status都变为Terminated后，点击Close。然后再打开MassHunter工作站。注意：在MassHunter采集软件关闭后，再次打开之前，必须执行上面的操作，否则无法进入采集软件。 5. 点击Standby按钮，检查前级真空（典型值应≤2.5Torr）和高真空，等到高真空≤2×10-6Torr后，关闭工作站。 6. 进入仪器诊断软件界面，在菜单上选择Connection > Connect，输入IP地址 192.168.254.12，点击OK。 根据不同的情况，选择不同的Condition HV的模式。0.6 Hour Cycle (Quick Vent) 适用于Q-TOF短暂关机后的Condition，比如更换泵油，短时间停电等。2 Hour Cycle (Optics Service) 适用于对Q-TOF关机，进行简单维护后的Condition，比如清洗毖绅管等。8 Hour Cycle (TOF Service) 适用于对Q-TOF关机，进行比较长时间的维修后的Condtion，比如仪器出现故障后Agilent工程师上门维修后再次开机。13 Hour Cycle (Installation) 适用于Q-TOF安装时第一次开机后的Condtion；当者是比如长假关机后再次开机。 7. 标签栏显示Instrument ON/OFF界面，点击Condition HV。 8. 当Condition HV结束后，在File菜单上选择Connection > Disconnect，关闭TOF Diagnostics软件。 9. 重新进入MassHunter工作站。 二、调谐和校正
液相色谱-质谱联用(LC-MS) LCMS分别的含义是：L液相C色谱M质谱S分离（友情赠送：G是气相^_^） LC-MS/MS就是液相色谱质谱/质谱联用 MS/MS是质谱-质谱联用（通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等） LC-MS/MS与LC-MS比较，M（质谱）分离的步骤是串联的，不是单一的。 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。 色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。 现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。 一、色谱分离基本原理： 由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。 色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。 使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 二、色谱分类方法： 色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。 从两相的状态分类：
高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法 1 高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 2 常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。 2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（ 3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。 2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。 (1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；
(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，过滤白头正常，在检查； (3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。 2.1.1 压力过低压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。 2.2．漂移问题主要包括基线漂移和保留时间漂移。 2.2.1基线漂移一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：
飞行时间质谱系统 本产品由主机和计算机（含分析软件）组成，其中主机主要由激光器、质量检测器、靶板、真空泵组和开关电源组成。 飞行时间质谱系统Clin-ToF-Ⅱ通过检测生物大分子的分子量，使用蛋白指纹图谱技术，用于对口腔分离的乳酸杆菌、变异链球菌以及白色念珠菌的鉴定。 1.1 产品名称 本仪器全称为飞行时间质谱系统（Clin-ToF-Ⅱ） 1.2 产品型号 1.3 产品结构组成 由主机和计算机（含分析软件）组成，其中主机主要由激光器、质量检测器、靶板、真空泵组和开关电源组成。 2.1外观 外壳应表面整洁，色泽均匀，无伤斑，裂纹等缺陷； 文字和标志应清晰可见；各指示或显示装置应准确清晰； 塑料件应无起泡、开裂、变形以及灌注物溢出现象； 控制和调节机构应灵活可靠，紧固部位应无松动。 2.2技术参数(性能要求) 2.2.1质量测量范围 质谱仪检测离子的质荷比范围为1540Da ～16950Da 。 2.2.2准确度 2.2.2.1内标法 以参考品B完成校对后，参考品A、C的质量漂移应在800ppm内；以参考品D完成校对后，参考品E的质量漂移应在1500ppm内；以参考品F完成校对后，参考品G的质量漂移应在800ppm内。 2.2.2.2外标法 参考品A、B、C、D、E、F、G分别点在靶板上邻近的两点，以其中一点的参考品进行校对，另一点内的参考品质量漂移应在1500ppm内。 2.2.3灵敏度 表示质谱仪在一定信噪比下能够出峰的所需样品量。浓度为10 fmol/μl 的参考品A、浓度为20 fmol/μl的参考品B、浓度为2pmol/μl的参考 品C、浓度为5pmol/μl的参考品D、浓度为10pmol/μl的参考品E条件下，检测参考品A、B、C、D、E，应有信噪比 (S/N) ＞3的出峰。 2.2.4分辨率 50 < 分辨率 < 3500。 2.2.5重复性 检测参考品A、B、C、D、E物质，重复15次实验，CV＜1%。 2.3系统功能
液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索 一、实验目的 1、了解LC-MS的主要构造和基本原理； 2、学习LC-MS的基本操作方法； 3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。 二、实验原理 1、液质基本原理及模式介绍 液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。 但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。 质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。 （一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。实例：（Q1 = 100-259m/z） （二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。实例：（Q1 = 259m/z） 本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：
Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动，当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（ 1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（ 4 ）页输入后按【Exit 】；在第（6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位
液相色谱串联质谱联用仪检测技术 实验指导 （2014、2015级） 课程内容（一个实验8学时）： （1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。 （2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。 吉林农业大学农业部参茸质检中心 2017.03
实验一AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用 一.实验目的和意义 通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。 （一）检测仪器 1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems公司）。 2、仪器组成液相色谱部分：岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分：QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱。 3、主要性能指标离子化方式：ESI电离质量范围：（5 ~ 1700）amu 分辨率：> 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（m/z : 609/195），信噪比S/N > 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度：< 0.01%（全质量数范围） 4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。4500QTRAP 的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成。Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成。
飞行时间质谱技术及发展 前言：质谱分析是现代物理与化学领域使用的极为重要的工具。目前日益广泛的应用于原子能，石油以及化工，电子，医药等工业生产部门，农业科学研究部门及物理电子与粒子物理，地质学，有机，生物，无机，临床化学，考古，环境监测，空间探索等领域[1]。飞行时间质谱飞行时间质谱仪较其他质谱仪具有灵敏度好、分辨率高、分析速度快、质量检测上限只受离子检测器限制等优点，再配合电喷雾离子源基体辅助激光解析离子源[2]大气压化学电离源等离子源，使之成为当今最有发展前景的质谱仪。飞行时间质谱已用于研究许多国际最前沿的热点问题，是基因及基因组学、蛋白质及蛋白质组学、生物化学、医药学以及病毒学等领域中不可替代的有力工具，例如肽和蛋白分析、细菌分析、药物的裂解研究以及病毒检测。特别是在大通量、分析速度要求快的生物大分子分析中，飞行时间质谱成为唯一可以实现的分析手段，例如与激光离子源联用或作为二维气相色谱的检测器等。本文将介绍飞行时间质谱的基本原理、技术及仪器的发展历程。力求对该仪器技术有一个较清楚的认识，并对今后相关的研究工作提供建设性帮助。 1.飞行时间质谱的工作原理：TOF-MS分析方法的原理非常简单。这种质谱仪的 质量分析器是一个离子漂移管。样品在离子源中离子化后即被电场加速，由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器，假设离子在电场方向上初始位移和初速度都为零，所带电荷数为q，质量数为m, 加速电场的电势差为V, 则加速后其动能应为： m v2 / 2= qe V 其中，v 为离子在电场方向上的速度。 离子以此速度穿过负极板上的栅条，飞向检测器。离子从负极板到达检测器的飞行时间t，就是TOFMS 进行质量分析的判据。在传统的线性TOFMS，离子沿直线飞行到达检测器；而在反射型TOFMS 中，离子经过多电极组成的反射器后反向飞行到达检测器，后者在分辨率方面优于前者。 2.飞行时间质谱的发展： 由于存在初始能量分散的问题，提高飞行时间质谱分辨率一直是研究者和仪器制造上努力的目标。仪器技术的进展也主要围绕这一目标进行。 2.1离子化技术的发展：最初TOFMS采用电子轰击的方法进行离子化。由电子枪产生的电子电离样品分子使其离解为离子，经加速形成离子束进入飞行区。这种方法可用于气、固、液体样品的分析。其缺点是：1)离子化时间较长，和一般离子的飞行时间数量级相近，容易引起大的误差；2)电子的电离及其进样方式，难以进行大分子样品的分析。目前这种离子化方式多用于小分子的分析。而新的电子发生方式如激光电子枪开始出现。后来脉冲离子发生器应用逐步广泛。用于固体或液体样品的重离子轰击、等离子体解吸(PDMS)及二次离子质谱(SIMS)属于此列。目前脉冲激光技术应用最广，包括激光解吸(LD)、共振激光离子化(RI)、共振加强单多光子离子化（RES/MPI）以及生化分析中常用的基质辅助激光解吸[4] (MALDI))等，适用于不同样品的分析。例如共振激光离子化可用于痕量金属元素的分析[3]。REMPI 则擅长复杂有机物的选择性离子化；MALDI的优点在于：1）可获得高的灵敏度，甚至能检测到离子化区的几个原子；2）对于热不稳定的生物大分子可实现无碎片离子化；3）对固体、液体表面分析，可以很好地控制离子化的位置或深度样品，分析时间大大缩短；4）可以与不同的离子化方式相结合。为解决多肽、蛋白、寡糖、DNA测序等生命科学领域中的前沿分析课题，需要发展特殊电离技术以及超高分辨、高灵敏度、大质量范围、多级串联的高档
This analyser is commonly called the TOF. The TOF is used in single MS systems, with an LC introduction, with a GC introduction, or with MALDI ionisation. In MS/MS configuration, the TOF is associated to a quadrupole (QTof), or to another TOF (TOF-TOF) or to an Ion Trap (QIT/TOF). Principle of the time of flight analyser:In a Time–Of–Flight (TOF) mass spectrometer, ions formed in an ion source are extracted and accelerated to a high velocity by an electric field into an analyser consisting of a long straight ‘drift tube’. The ions pass along the tube until they reach a detector. After the initial acceleration phase, the velocity reached by an ion is inversely proportional to its mass (strictly, inversely proportional to the square root of its m/z value). Since the distance from the ion origin to the detector is fixed, the time taken for an ion to traverse the analyser in a straight line is inversely proportional to its velocity and hence proportional to its mass (strictly, proportional to the square root of its m/z value). Thus, each m/z value has its characteristic time–of–flight from the source to the detector. Time of Flight equations:The first step is acceleration through an electric field (E volts). With the usual nomenclature (m = mass, z = number of charges on an ion, e = the charge on an electron, v = the final velocity reached on acceleration), the kinetic energy (mv /2) of the ion is given by equation (1). mv /2 = z.e.E(1) Equation (2) follows by simple rearrangement. v = (2z.e.E/m)1/2(2) If the distance from the ion source to the detector is d, then the time (t) taken for an ion to traverse the drift tube is given by equation (3). t = d/v = d/(2z.e.E/m)1/2 = d.[(m/z)/(2e.E)] 1/2(3) In equation (3), d is fixed, E is held constant in the instrument and e is a universal constant. Thus, the flight time of an ion t is directly proportional to the square root of m/z (equation 4). t = (m/z) 1/2 x a constant(4) Equation (4) shows that an ion of m/z 100 will take twice as long to reach the detector as an ion of m/z 25: going through the reflectron, the dispersion of ions of the same m/z value is minimized, leading to a great improvement of resolution