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免疫组化的注意事项、操作要点和技巧一些教训：1、对于多甲灌注固定的标本，如要长期保存，要先脱水后冻存，此法对于采用漂片法IHC 较适合。
正确操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——蔗糖梯度脱水——负70度保存——冰冻切片错误操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——负70度保存——蔗糖梯度脱水——冰冻切片，结果是会有大量冰晶形成。
2、如果能确认使用石蜡切片并使用贴片法进行下一步IHC，多甲或甲醛后固定后应尽快脱水并石蜡包埋。
要点和操作技巧：1.固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
免疫组织化学注意事项1、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
2、组织脱水必须彻底干净。
3、切片必须完整、均匀、平展、无皱折。
4、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。
新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。
然后再将载玻片浸入3－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy- silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。
5、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原，切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。
6、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果。
7、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。
H2O2甲醇较适合于大多数的情况，因为除了H2O2外，甲醇对各种酶，都有钝化的作用，因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。
8、抗体的加入须注意的问题：①当PBS冲洗完毕后，在加入抗体，如一抗，二抗或三抗。
必须将存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能让切片干涸，切片干涸，往往可产生非特异性染色，切片上PBS存留过多，将会稀释加入的抗体，影响加入抗体的浓度，同时也将影响最后的结果，如假阴性等。
②加入的抗体以一滴为佳。
当擦干组织块周边多余的PBS后，切片保持着一定的湿润度，此时加入另外的抗体为最佳时候，滴入抗体以一滴50μl为好，加入后，轻微地摇匀地覆盖于切片上，使最后的结果稳定均衡，不至于有的地方有反应，有的地方无反应。
③切片没擦好将会影响加入抗体的质量。
当加入抗体后，它可缩于切片的一边，此时你为了使加入的抗体能够完全地覆盖整个切片，便会使劲地加入抗体，此时的结果是，抗体依然滑向一边，或者完全露出，这不光没达到目的，还浪费抗体，正确的做法就是彻底地用PBS冲洗，摔干切片擦干切片周边的PBS，再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。
山西大鼠免疫组化注意事项山西大鼠免疫组化是一种常用的实验方法，用于研究动物体内特定蛋白质的分布、定位和表达水平。
在进行山西大鼠免疫组化实验时，我们需要注意以下几个方面：1. 实验前的准备：a. 安全措施：在进行实验前，我们需要确保自己和工作环境的安全。
戴上实验手套、护目镜，使用无菌技术操作，避免对自己和他人的伤害，同时避免实验物质的交叉污染。
b. 材料准备：准备好所需的实验材料，包括动物标本、抗体、缓冲溶液、荧光染料等。
2. 样本处理：a. 采集样本：选择与研究目的相关的组织进行免疫组化实验。
采集组织样本时，需要注意正确的取样位置和方法，尽量避免血管和其他组织的污染。
b. 保存样本：采集到的样本需要进行固定处理，以保持组织结构和抗原的稳定性。
可以使用4%的冷冻乙醛或其他适当的固定剂进行固定，然后进行常规的组织处理。
3. 免疫组化实验步骤：a. 抗原修复：固定的组织样本需要进行抗原修复，以恢复蛋白质的免疫反应性。
常用的抗原修复方法包括热蒸汽法、酶解法或酸性修复液法。
选择适当的方法进行抗原修复，不同抗体可能需要不同的修复方法。
b. 阻断非特异性结合：使用阻断剂（如BSA或牛血清蛋白）对样本进行预处理，以防止非特异性结合和减少背景信号。
c. 抗体和探针标记：根据研究目的选择合适的一抗和二抗，并为二抗选择适当的荧光染料或酶标记试剂。
在实验过程中，注意对抗体和探针的适应性、纯度和稀释倍数。
d. 免疫反应：将样本与一抗和二抗进行孵育，以实现抗原-抗体的特异性结合。
在孵育过程中，控制好反应温度、时间和免疫反应液的成分，避免产生假阳性或假阴性结果。
e. 染色和显微镜观察：根据探针的不同选择适当的染色方法，如免疫荧光染色和酶标染色。
使用显微镜观察样本，并拍摄照片记录结果。
4. 数据分析和结果解释：a. 图像获取：使用显微镜或其他适用的成像系统获取染色图像，确保图像清晰、对比度适当。
b. 图像分析：使用图像分析软件对图像进行定量分析，包括颜色分离、荧光强度分析、目标定位等，得出相应的数量测量和定量结果。
免疫组织化学中的注意事项
免疫组织化学是一项重要的实验技术，在生命科学研究中有着广
泛的应用。
然而，进行免疫组织化学实验需要注意一些细节和技巧，
以确保实验结果的准确性和可重复性。
以下是一些免疫组织化学中的
注意事项。
1. 标本预处理：标本的质量对结果影响很大。
在进行组织染色前，需要对标本进行处理，如切割、固定、脱水等。
标本中的脂类和胆固
醇会干扰标本的染色过程，因此需要彻底去除。
2. 抗体和抗原的配对：在进行免疫组织化学染色时，抗体和抗原
的配对至关重要。
不同的抗体可能对同一抗原具有不同的亲和力和特
异性，因此需要根据实验需要选择适当的抗体。
3. 免疫染色的条件：免疫染色条件也需要严格控制。
温度、时间
和缓冲液的组成都可以影响染色效果。
一些组织样本可能会对染色条
件很敏感，因此需要在实验过程中不断优化条件。
4. 染色结果的评估：染色结果需要准确评估，包括染色强度、特
异性和位置等。
这需要使用显微镜进行观察和分析，并需要有足够的
经验来检验染色结果的可靠性。
综上所述，免疫组织化学实验需要严格控制各项细节，并需要有
充足的实验经验和科学思维能力。
只有这样，才能获得可靠的实验结
果并推动生命科学的发展。
免疫组化检查要注意点什么免疫组化检查是一种常见的临床化验技术，主要用于检测体内免疫系统的功能和免疫相关疾病的发生及发展情况。
免疫组化检查的主要原理是利用抗原与抗体的特异性结合来检测样本中的分子，以达到诊断和评估疾病的目的。
在进行免疫组化检查时，有一些注意事项需要关注。
首先，样本采集和保存非常重要。
样本采集的质量直接影响到后续检测结果的准确性。
对于不同的免疫组化检测项目，样本的要求也不尽相同。
比如，某些检测要求新鲜样本，不能冷冻，而另一些则需要冷冻保存。
因此，在采集样本前，需要了解具体检测项目的要求，并按照要求进行适当的处理和保存。
其次，在进行免疫组化检查时，需要正确选择和识别抗原与抗体。
不同的免疫组化检测方法所用到的抗原和抗体可能存在差异，因此，在进行检测前需要准确选择所需的试剂和抗体。
同时，为了保证检测结果的准确性和可靠性，必须进行负对照和阳性对照的设定。
负对照用于排除假阳性结果的干扰，阳性对照用于确认试剂和仪器的灵敏度和准确性。
第三，免疫组化检查中的标本制备和处理也非常重要。
对于不同类型的标本，如血液、组织、细胞等，其制备和处理方法也各有不同。
在制备标本时，要注意避免样本的污染和破坏，同时要保证标本中目标分子的完整性。
常见的标本处理方法包括切片、固定、脱水、染色等，这些步骤的操作必须严格按照标准操作程序进行，以保证结果的可靠性。
此外，免疫组化检查中的实验条件控制也非常重要。
例如，温度、湿度、阴离子或阳离子含量、光照等因素都可能对结果产生影响。
因此，在进行检测时，需要严格控制这些条件，并在合适的环境中进行实验操作。
最后，对于检测结果的解读也需要谨慎。
免疫组化检查并不是绝对的诊断依据，而仅仅是一种辅助诊断方法。
结果的解读需要结合病史、临床表现和其他辅助检查结果来进行，必须进行全面综合分析。
总之，免疫组化检查作为一种重要的实验室技术，对于诊断和评估免疫相关疾病具有重要的意义。
在进行检测时，需要关注样本的采集和保存、正确选择和识别抗原与抗体、标本的制备和处理、实验条件的控制以及检测结果的解读等方面的注意事项。
免疫组化需注意的问题一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
为达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。
如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。
四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。
免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。
新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。
我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。
然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。
五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。
简述免疫组化实验流程及注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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免疫组化检测注意事项嘿，咱今儿就来说说免疫组化检测那些事儿！这免疫组化检测啊，就像是一场对细胞的大探秘，可不能小瞧了它。
你想想，细胞那么小，要搞清楚它们的情况可不容易。
就好像在一个满是人的大广场上，要找出特定的几个人一样。
免疫组化检测就是我们的法宝啦！但要做好这个检测，可得注意好多细节呢。
首先说样本，那可是检测的基础啊！样本要是没采集好，就好比盖房子没打好地基，后面可就麻烦啦。
采集样本的时候可得小心再小心，别把不该采的采进去了，也别把该采的给弄丢了。
就跟做饭似的，食材不好，怎么能做出美味佳肴呢？然后就是实验过程啦，这可得像走钢丝一样，小心翼翼。
各种试剂就像是不同的调味料，加多加少都不行，得恰到好处。
温度、时间这些也都得把握好，不然结果能准吗？这就跟烤蛋糕一样，火候不对，蛋糕不就烤砸啦？还有啊，操作的时候一定要仔细认真，不能有一丝马虎。
一个小失误可能就会让结果大不一样，那可就误大事了。
这就像绣花，一针一线都得精心，不然绣出来的花能好看吗？检测人员也得专业呀，他们就像是经验丰富的侦探，能从那些小小的线索中找出真相。
要是个新手，那能行吗？那不等于让个小孩子去破案嘛！而且做完检测后，分析结果也很重要。
不能看到个结果就随便下结论，得综合考虑各种因素。
这就像解一道难题，得一步一步分析，不能着急。
咱可得重视免疫组化检测呀，这可是关系到健康的大事呢！只有把每个环节都做好，才能得到准确可靠的结果，才能更好地帮助医生诊断和治疗疾病。
不然，那不是白忙活一场嘛！大家说是不是这个理儿呀？所以啊，大家一定要牢记这些注意事项，让免疫组化检测发挥出它最大的作用！原创不易，请尊重原创，谢谢!。
免疫组化实验安全操作及保养规程免疫组化实验是一种常见的生物实验方法，适用于研究细胞、组织和生物分子中的蛋白质、抗原、受体等成分。
由于实验过程中使用的试剂和仪器具有一定危险性，因此必须遵守严格的操作规程，保证实验过程的安全性。
实验前的准备工作在进行免疫组化实验之前，需要对操作环境和实验材料进行准备工作，以保证实验结果的可靠性和安全性。
1. 操作环境准备实验操作室应该保持干净、整洁，照明充足，通风良好，避免有光、霉、水等因素影响实验。
实验室的桌面、器皿、设备和工具等应当进行彻底清洁和消毒，以避免杂质和污染对实验结果的影响。
2. 实验材料准备实验中需要使用的试剂、仪器和材料等应当选择高质量、纯度高、新鲜的。
对于已经开启的试剂或精制纯化的试剂，需要进行贴标签、标注到访日期及有效期等细节行政工作，并存储在恰当的环境中。
对于易燃、危险、腐蚀性等试剂，应当按照标签上的提示来使用和储存。
实验操作规程1. 实验前的准备工作在进行实验的过程中，需要进行一些准备工作，以确保实验操作的安全性和效果。
1.1 确认工作计划。
在进行实验之前，需要准确确认各项工作任务及操作步骤，制定完备的计划；1.2 了解操作材料。
事先应该对实验所用材料进行充分的了解，确认试剂品牌、浓度、储存条件等；1.3 安全措施准备。
事先做好实验操作中可能出现的事故应急预案，并准备好包括防护手套、防护面罩、实验室长袍、安全鞋等安全防护设备；1.4 操作台面准备。
在操作过程中，准备好所需的实验器皿（包括台盘、离心管等）、显微镜镜片、吸管等等。
2. 操作注意事项在进行免疫组化实验过程中，需要注意如下事项：2.1 严格保持操作技能的标准. 实验人员应当具备一定的实验操作技能，并开展专业工作前进行技能测评；2.2 实验室的基本卫生防护：实验人员每日早晚必须进行体温检测，佩戴口罩，严格按照个人防护要求操作。
实验器材的消毒和洗涤。
对于特殊实验室要求的实验操作，需要进行进一步的防护措施；2.3 操作前的试剂准备. 在进行实验之前，需要先将需要使用的试剂进行准备、调配、稀释等操作，并严格遵守生物实验室规定的标准操作；2.4 仪器的维护。
(四) 注意事项
1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。
有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或B SA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。
其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。
目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。
不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。
吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。
蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。
选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。
对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。
然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而
本身无色。
有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。
有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。
底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。
通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。
底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
常见问题处理：
免疫组化常见问题的处理
当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。
比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。
需要注意的是，有些底物在制
成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：
① 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
④ 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
⑤ 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色
① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。
应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步
骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。
处理的方法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7. 6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol /L的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。
具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
② 是否选择使用了正确的封闭血清。
电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。
有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。
另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。
最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
③ 所选择的抗体是否符合试验要求。
因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
④ 一抗的使用浓度是否过高。
⑤ 清洗是否充分。
应严格操作规程。
因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。
特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥ DBA的使用是否正确。
DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型D AB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。
另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。
孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
免疫组化和western blot验证蛋白质上有什么区别？
要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？
① 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
② 两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
单克隆与多克隆抗体的区别：
这首先要从抗体的产生来探讨。
把某一抗原免疫某种动物而得到单抗或多抗。
如果用经免疫过的动物的脾细胞获得杂交瘤细胞，则得到单克隆抗体，如果用动物的血清，则得到多克隆抗体。
但从理论上说，这些抗体都应针对抗原来自的动物，例如如果用人蛋白抗原免疫小鼠，则这些抗体为鼠抗人。
由于一个大蛋白分子表面具有多种抗原决定簇，因此，免疫动物后，这些不同的决定簇分别诱导动物产生不同的抗体，每种抗体的特异性不同。
单抗是有单个细胞起源的细胞克隆分泌的，所以只针对蛋白抗原的单一抗原决定簇，而多抗是有多个不同克隆的B细胞产生的，是多种细胞的混合物，但其中的每一种抗体也只是针对一种决定簇。
多抗混合物中的每一抗体与蛋白抗原结合的能力是不同的，因此用多抗做实验与用单抗可有其优势，那就是能确保抗体与抗原结合从而显示抗原信息。
但也有其缺点，那就是交叉反应，往往造成假阳性。
从理论上说，用人抗原诱导产生的抗体应只能用于人类，但由于动物种属之间，特别是相近的动物之间，如人与猩猩，大鼠与小鼠存在着同源性，导致抗体的交叉反应，即用一种动物抗原诱导产生的抗体也可与其它一些动物的抗原反应。
一般在商品化的产
品说明书上都有说明。
由于单抗只针对单一抗原决定簇，因此，其能导致的交叉反应很少，而多抗是混合物，导致的交叉反应就多一些。
但并不是向你所认为的那样，多抗可与所有种属动物反应。
在选择抗体时，如果你标本来源于人，当然应选用如鼠抗人或兔抗人等。
如果抗体来源确实不清，那应该先预实验。
选择已知阳性标本，在充分设置阴性对照的前提下，用此抗体染色，看能否显示阳性结果。
