下载文档原格式
碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义:1.国内外研究现状碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。
1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。
碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。
由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。
研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。
海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。
迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。
海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。
相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。
综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。
首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。
其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。
2.选题依据及意义此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。
大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。
最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。
本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。
高产碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质的研究高产碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质的研究摘要：蛋白酶是一类广泛存在于生物体中的酶类，其具有多种功能。
碱性蛋白酶是一类pH值适宜碱性环境下活性较高的蛋白酶，应用广泛。
本研究旨在筛选出一株高产碱性蛋白酶的菌株，并对其酶学性质进行研究。
引言：蛋白酶在生物体内起着关键的生物调节和代谢调控作用。
碱性蛋白酶是一类活性较高、pH值适宜碱性环境下较为稳定的蛋白酶，被广泛应用于生物工程、制药、食品加工等领域。
因此，筛选高产碱性蛋白酶菌株并对其酶学性质进行研究具有重要意义。
材料与方法：本研究选取了富含烟碱的土壤样品作为实验用菌株的来源。
首先进行了初步筛选，将土壤样品分别接种于含有碱性蛋白酶基质的琼脂平板上，并在适宜的培养条件下进行孵育。
随后，对形成菌落的菌株进行二次筛选，通过培养基的碱性蛋白酶活性测定，筛选出活性较高的菌株，并进行进一步培养。
结果：经过初步筛选和二次筛选，从富含烟碱的土壤样品中分别筛选出了两株高产碱性蛋白酶的菌株。
其中，菌株A的碱性蛋白酶活性达到了每毫升1000 U，菌株B的碱性蛋白酶活性为每毫升800 U。
讨论：这两株高产碱性蛋白酶的菌株在富含烟碱的土壤样品中被筛选出来，表明烟碱可能对菌株具有诱导产碱性蛋白酶的作用。
此外，本研究所筛选出的菌株的蛋白酶活性较高，这对于蛋白质降解和利用具有积极的意义。
酶学性质：对菌株A和菌株B分别进行了酶学性质的研究。
结果表明，这两株菌株的碱性蛋白酶在pH 9.0的条件下具有较高的活性，其酶活性逐渐下降，当pH值低于7.0时基本失活。
在温度方面，菌株A的蛋白酶活性在40°C达到最高值，而菌株B的最适温度为45°C。
进一步的研究发现，菌株A的蛋白酶受到金属离子Cu2+的抑制，而菌株B的蛋白酶对Cu2+较为稳定。
结论：本研究成功筛选出两株高产碱性蛋白酶的菌株，并对其酶学性质进行了研究。
结果显示，这两株菌株的碱性蛋白酶具有较高的活性，适应性较强。
碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义:1.国内外研究现状碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。
1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。
碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。
由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。
研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。
海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。
迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。
海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。
相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。
综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。
首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。
其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。
2.选题依据及意义此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。
大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。
最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。
本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究董静 201131301031摘要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37℃,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在pH在8-9区间和温度在25℃-37℃区间下稳定。
关键字：碱性磷酸酶分离纯化热稳定性酸碱稳定性碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。
此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。
它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。
药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。
它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程[1]。
临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。
因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。
本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。
此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料[2-3]。
耐热碱性蛋白酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究的开题报告一、研究背景及意义耐热碱性蛋白酶是一种有重要应用价值的酶，广泛应用于医药、食品、皮革、环境保护等行业中。
其特点是能在高温高碱环境下稳定地存在和发挥作用，因此受到了广泛关注。
目前，已经有许多研究针对耐热碱性蛋白酶的产生菌株、分离鉴定及酶学特性进行了探究，但在实际应用中，仍存在一些问题需要解决，如酶的稳定性、效率和产量等方面，因此有必要进一步深入研究。
二、研究内容和方法本研究旨在分离鉴定耐热碱性蛋白酶产生菌株，并研究其基本酶学性质，为酶的进一步研发应用提供参考。
具体研究内容如下：1. 采集多种自然环境中的样品，如土壤、水、植物、动物等，通过培养分离的方式筛选产生耐热碱性蛋白酶的菌株；2. 对所得到的菌株进行形态学特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法进行鉴定，筛选出优良的菌株；3. 通过固体和液体发酵的方法大量制备菌株产生的耐热碱性蛋白酶；4. 研究酶的基本酶学性质，包括最适温度、最适pH值、热稳定性、抑制剂对酶的影响等；5. 对酶的酶动力学特性进行研究，包括酶的动力学常数、Michaelis-Menten方程、反应速率等。
三、预期结果本研究将分离鉴定出优良的耐热碱性蛋白酶产生菌株，并对酶的基本酶学性质和酶动力学特性进行研究，预计能够得到以下结果：1. 获得产生耐热碱性蛋白酶的优良菌株，为耐热碱性蛋白酶的基础研究和产业应用提供了可靠的物质基础；2. 揭示耐热碱性蛋白酶的基本酶学性质和酶动力学特性，为其进一步应用提供理论支持；3. 为该领域的后续研究提供实验方法和实验结果的参考，推动本领域的发展。
四、研究难点及解决思路本研究面临的主要难点在于如何获得稳定、高效率和高产量的耐热碱性蛋白酶，以及如何解决酶在产业应用中的稳定性问题。
针对这些问题，我们将采取以下解决思路：1. 进行大量的筛选和优化实验，从多个样品中挑选最适合的菌株进行培养和发酵；2. 通过改变培养条件、添加助剂等方法，优化酶的产量和活性，使其符合产业应用的需求；3. 在产业应用中，注意酶的保护和稳定性，避免不必要的失活和损失。
学方法的创新,只求维持现状,久而久之便导致了职业倦怠现象的出现。
表2的调查结果显示,经常产生挫折感的体育教师占2.3%;有时产生挫折感的体育教师占39.5%;很少产生挫折感的体育教师占41.2%,从未产生挫折感的体育教师占16.9%。
说明体育教师在工作中遇到挫折感的现象普遍存在,并且男性比女性更加明显。
经常感到情绪疲惫的体育教师占27. 7%,有时感到情绪疲惫的体育教师占46. 3%,男性体育教师情绪疲惫程度明显高于女性,说明情绪疲惫是体育教师产生倦怠情绪的主要成因之一。
经常处于过度工作状态的体育教师占15.3%,有时处于过度工作状态的体育教师占59.1%,从未感到过度工作的体育教师仅占8.5%,说明过度工作状态是体育教师产生倦怠情绪的又一主要成因。
经常有改行打算的体育教师占5.1%,有时有改行打算的体育教师占44.1%,说明体育教师打算改行的现象较为普遍。
工作中有41.2%的体育教师从未获得过满足感,说明这部分人群是造成高校体育师资流失的主要群体,其中在工作中获得满足感的女性明显低于男性。
21.5%的体育教师在工作中感觉精力不足,女性体育教师精力充沛感明显低于男性体育教师。
在对待情绪问题上,仅有2.3%的体育教师能够冷静处理,说明体育教师在处理问题时情绪易波动,这与体育教师表现的好竞争、易急躁、易动性等人格特征相符合。
有74.0%的体育教师担心在工作中会逐渐失去耐心,说明体育教师在工作中的心理焦虑水平较高。
以上调查结果表明,陕西省高校体育教师的职业倦怠状况已较为普遍,具体表现在三个方面。
(1)女性体育教师的厌倦心理明显高于男性。
其成因主要是因为男性往往把事业放在第一位,其价值主要体现在社会地位、工作收入、职位方面,女性则把家庭放在第一位,所以工作中易表现出倦怠心理。
(2)31-40岁阶段厌倦心理较为严重,究其原因与教师在不同的阶段所关注的问题不同所致。
关注生存阶段的体育教师(30岁以下)由于正处于理想的狂热期,往往会不知疲倦投入工作,加之经验和资历的不足,对职称晋升、职位升迁的期望值也不高,付出多于回报的感觉也不很强烈,因此倦怠程度较低。
碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究碱性蛋白酶(alkaline protease)是一类最适pH为碱性的蛋白酶,是一种非常重要的水解酶类,在医药、饲料、食品等领域中都有广泛应用。
本论文以Cellulomonas bogoriensis sp.nov为出发菌株,对其产酶条件、碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质等方面进行了研究,并得到以下结论:利用单因素法和响应面Box-Behnken组合设计方法对菌株产碱性蛋白酶的发酵条件进行了优化,得出菌株最佳产酶条件为:培养温度30℃,培养基初始pH 10.5,装液量75/250 mL,1.5%(w/v)蔗糖为碳源、1.5%(w/v)的牛肉膏酵母浸粉(1:1)为混合氮源、NaCl 含量为2.67%(w/v),培养时间120 h。
经硫酸铵分级沉淀和CM Sepharose Fast Flow柱层析纯化得到一个相对分子质量约为18.3 kDa的碱性蛋白酶,纯化倍数为10.83,回收率为25.79%。
酶的最适反应温度70℃,最适pH为11.0。
在4-60℃、pH3.0-12.0范围内酶活力稳定;1 mM的Mg2+、Fe2+会增加蛋白酶活力;而1 mM的Ba2+、Mn2+、Ca2+对蛋白酶活力几乎没有影响,但在10mM时会明显抑制蛋白酶的活力。
EDTA浓度为10m M时,碱性蛋白酶的酶活力仍能达到77%。
抑制剂PMSF,TPCK对酶有强烈的抑制作用,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶家族中的胰凝乳蛋白酶。
酶对甲醇、乙醇、甘油等有机溶剂具有较强的耐受能
力,Triton X-100强烈抑制酶活力。
该蛋白酶最佳作用底物为酪蛋白,可以水解血红蛋白和牛血清白蛋白,不能水解明胶和胶原蛋白,米氏常数Km为19.2μg/mL,Vmax为2000μg/min。
该蛋白酶与市售的洗涤剂均有良好的相容性,具有良好的脱毛效果、处理血污的能力和
耐盐性。
测定了该酶的N端序列,为FDVIGGNAYT。
本论文纯化的碱性蛋白酶具有耐碱性、耐高温、耐盐及耐有机溶剂等优良的特性,在皮革、洗涤等工业生产中具有应用前景。
