Total Exosome RNA and Protein Isolation Kit中文版
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Total Exosome RNA and Protein Isolation Kit
总论：对于提取exosome RNA用于测序的样品，源于细胞上清的液体应不少于5ml，来源于血清的样品应不少于200ul。
Isolate exosomes with ExoQuick-TC
1.收集新鲜细胞培养上清10ml，3000 × g离心15min去除细胞碎片；
2.转移上清到一无菌15ml离心管，加入2ml ExoQuick-TC试剂，颠倒混匀后4°C放置过
夜；
3.将上清与ExoQuick-TC试剂混合液分成两管后，4°C 、1500 × g离心30 min, exosome
沉于管底；
4.将管4°C 、1500 × g再离心5 min，完全吸走上清；
5.按接下来的实验选择合适的缓冲液100µl - 500µl。
Procedure
准备工作：
2－巯基乙醇（14.3M），无水乙醇/ACS，PBS，10,000xg以上离心机，加热器100°C，真空抽滤泵，RNase-free处理的管/枪头。
2X Denaturing Solution
向2X Denaturing Solution中加入375ul 2－巯基乙醇，注意：2X Denaturing Solution在2°C 到8°C可能会凝固，在使用前37°C预热5－10min,边热边摇，直到完全溶解，并做好标记。
miRNA Wash Solution 1
往miRNA Wash Solution 1中加入21ml无水乙醇，充分混匀后，做好标记
Wash Solution 2/3
向Wash Solution 2/3中加入40 ml无水乙醇，混匀做好标记，注意：此溶液中可能会出现沉淀，使用时避免吸取沉淀即可。
聚集exosome沉淀与重悬
1.用预冷的Exosome Resuspension Buffer重悬exosome沉淀，加入的量由exosome量来
决定，可以从25 μL 到1 mL；
2.室温下，孵育5－10 min使exosome充分溶解，装入RNase-free EP管中；
3.小心吹打，充分重悬沉淀，溶解好后，进行RNA抽提或者直接用于蛋白抽提工作；
4.若同时进行RNA的抽提和蛋白实验，把样品分成两份，先提RNA(注意计量吸取
exosome的体积)，用于蛋白那份可先放－200C冰箱冻存。
Isolate RNA –Organic extraction
1.加入同倍体积的2X Denaturing Solution混合均匀，2X Denaturing Solution在37°C预
热；
2.若体积不足200ul的加PBS补足到200ul,超过的计量体积进行下行实验；
3.混合液在冰上裂解5分钟
4.往混合液中加入同等体积的Acid-Phenol/Chloroform（如起初溶解体积为200ul，后面
加的200 μL体积2X Denaturing Solution，那么最终加入的Acid-Phenol/Chloroform为200+200=400ul）,避免接触底层酚相；
5.旋涡样品30–60s充分混匀；
6.用超过10,000 x g室温离心5min,使混合液分成上清相各有机相，若分层不好，再重
复离心一次；（选用12000Xg离心力，时间为10min）；
7.小心将上层清液转移到另一干净RNase-free EP管中，注意吸出的液体体积；
8.进行RNA的纯化步骤。
Isolate RNA – Purify the RNA
实验前先准备：Elution Solution预加热到95°C（用EP管分装500ul预热），ACS 100%的乙醇必须要在室温使用，若无水乙醇是先预冷的要先经预热到室温才能使用。
Bind the RNA
1.吸1.25倍无水乙醇到上清液，混匀（如，有300ul上清水相，加375ul无水乙醇）；
2.对于每个样品，准备一个滤筒和一个收集管（提取试剂中有）；
3.吸取700ul混合液在滤筒上，若体积大于700ul,滤完一次后，用同一滤筒滴加其余的液
体再过滤；
4.室温下10,000 × g 离心~15 seconds，或用真空抽滤泵，直到所有的液体都能过滤筒；
5.倒掉收集管中的废液，重复步骤4一次保证所有液体通过滤网筒，保留收集管用于下一
步洗脱实验。
Wash the RNA
1.加700ul miRNA Wash Solution 1到滤筒（加了无水乙醇的工作液）；
2.室温下10,000 × g for ~15 seconds，或用真空抽滤泵，直到所有的液体都能过滤筒，滤
完后，倒去废液，将滤网筒重新放回旧收集管中；
3.吸500 μL Wash Solution 2/3 (加好无水乙醇的工作液)；
4.10,000 × g for ~15 seconds，或用真空抽滤泵，直到所有的液体都能过滤筒；
5.重复第3，4步一次；
6.弃完收集管中的废液后，再10,000 × g 离心1 min滤干残余的液体。
Elute the RNA
1.将滤筒转移到一新的收集管中
2.加入50ul 95°C预热的Elution Solution或nuclease-free water到滤网筒正中间（Elution
Solution分装500ul到RNase-free EP管中预热）；
3.室温下10,000 × g 离心~30 seconds，回收RNA，洗脱液中即为RNA溶解液（洗脱两次，
每次洗脱的RNA分管装，理论上第一次洗脱的RNA浓度远远大于第二次的RNA浓度）；
4.用50ul Elution Solution或nuclease-free water重新洗脱步骤一次，离心后，收集的即为
Total RNA;
5.提取的RNA放冰上用于下步实验或–80°C冻存长期保存。
