结肠癌组织中raf激酶抑制蛋白的表达及意义

实用医技杂志20圆园年1月第2苑卷第1期JournalofPracticalMedicalTechniques，允葬灶怎葬则赠20圆园，Vol.2苑，No.1

DOI：10.19522/j.cnki.1671鄄5098.2020.01.002作者单位：450003郑州，河南省人民医院病理科（李道宏、胡爱侠）；郑州大学第一附属医院病理科（陈壬寅、陈奎生）结肠癌组织中Raf激酶抑制蛋白的表达及意义李道宏陈壬寅陈奎生胡爱侠【摘要】目的检测人结肠癌组织中Raf激酶抑制蛋白（RKIP）的表达。方法采用免疫组织化学SP法检测60例结肠癌组织和60名正常结肠黏膜组织中的RKIP蛋白的表达。结果正常结肠黏膜组织中RKIP蛋白的阳性表达率为88%（53/60），高于结肠癌组织的48%（29/60）（P<0.05）。结肠癌组织中RKIP蛋白的表达与肿瘤的分化程度、浸润深度和淋巴结转移有关（P<0.05），与肿瘤患者性别、年龄、肿瘤生长部位、生长方式及有无脉管侵犯无关（P>0.05）。结论RKIP的低表达可能与结肠癌的发生和肿瘤细胞的浸润转移能力相关；检测RKIP的表达对判断结肠癌预后和转移有重要参考价值。【关键词】结肠肿瘤；Raf激酶抑制蛋白；侵袭；转移ExpressionandsignificanceofrafkinaseinhibitorproteinincoloncarcinomatissueLiDaohong，ChenRenyin，ChenKuisheng，HuAixia.DepartmentofPathology，HenanProvincialPeople'sHospital，Zhengzhou450003，China【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionofrafkinaseinhibitorprotein（RKIP）incoloncarcinomatissue.MethodsTheexpressionsofRKIPin60casesofcoloncarcinomatissueandnormalcolonmucosatissuesweredetectedbyusingimmunohistochemistry（SP）methods.ResultsTheexpressofRKIPinnormalcolonmucosatissuewassignificantlyhigherthanthatincarcinomatissue（P<0.05）.TheexpressionofRKIPincoloncarcinomatissuewassigni-ficantlyassociatedwithdifferentiation，invadinggradeandlymphnodmetastasisofcoloncarcinoma（P<0.05）.Onthecontrary，itwasnotcorrelatedwiththegender，age，orthesiteoftumorgrowth，growthpatternandvenousinvasion（P>0.05）.ConclusionThelowlevelexpressionofRKIPmayplayanimportantroleinoccurrenceofcoloncarcinomaandtheabilityoftheinvasion，metastasisandinpredictingthecarcinomaofrectumprognosisandmetastasis.【Keywords】Colonneoplasm；Rafkinaseinhibitorprotein；Invasion；Metastasis结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，发病率和病死率排在第3位和第5位[1]，我国结肠癌的发病率逐年上升[2]。因此，研究和探讨结肠癌的发生、发展及浸润转移机制，探讨新的治疗方案有重要意义。Raf激酶抑制蛋白（rafkinaseinhibitorprotein，RKIP）是磷脂酰已醇胺结合蛋白（PEBP）家族的成员。Vall佴e等[3]发现，RKIP在多种正常组织和不同类型细胞中都表达，而在肿瘤细胞中低表达或不表达。另有研究证实，RKIP能抑制前列腺癌、乳癌及恶性黑色素瘤的转移。在肿瘤转移细胞中均有RKIP表达水平下调，过表达的RKIP能在体外抑制侵袭的发生，而RKIP表达的丧失可导致肿瘤转移。为了解结肠癌组织中RKIP的表达情况，作者采用免疫组织化学方法检测了人结肠癌组织中RKIP的蛋白表达，以探讨其对结肠癌发生、发展、浸润和转移的影响，为临床肿瘤的治疗方案提供依据。1资料与方法1.1临床资料：选用河南省人民医院病理科2016年手术存档蜡块，其中结肠癌组织标本60例（术前均未做过抗癌治疗），每例结肠癌组织病理切片均由2位专家确认诊断。正常组织取自上述60例标本残端（距癌组织3cm以上）。60例中男性36例，女性24例；年龄：臆50岁者13例，51~69岁者33例，逸70岁者14例。分化程度：高分化19例，中低分化41例；浸润深度：浅层24例（浅肌层以内），深层36例（深肌层至浆膜层）；大体类型：溃疡型29例，浸润型12例，隆起型19例；部位：结肠28例，直肠32例；有脉管侵犯12例，无脉管侵犯48例；有淋巴结转移22例，无淋巴结转移38例。1.2主要试剂和检测方法：RKIP为兔抗人多克隆抗体（SantaCruz公司），SP免疫组织化学试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒（北京中杉金桥公司）。用免疫组织化学SP法，按照试剂盒说明书，主要步骤是：石蜡切片脱蜡至水，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次伊5min，加过氧化物酶阻断溶液（试剂A），室温孵育10min，PBS冲洗3次伊5min，加非免疫性动物血清（试剂B），室温孵育10min，加稀释好的一抗（1颐100），室温孵育60min，PBS冲洗3次伊5min，加生物素标记的二抗（试剂C），室温孵育10min，PBS冲洗3次伊5min，加链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶溶液（试剂D），室温孵育10min，PBS冲洗3次伊5min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。用已知阳性的黑色素瘤组织切片作为阳性对照，用PBS代替2种8窑窑实用医技杂志20圆园年1月第2苑卷第1期JournalofPracticalMedicalTechniques，允葬灶怎葬则赠20圆园，Vol.2苑，No.1一抗为阴性对照。1.3结果判定[4]：RKIP阳性细胞为胞质着色，呈棕黄色，以出现棕黄色颗粒为阳性。每例标本细胞计数均取5个高倍视野的平均数，计算阳性细胞所占百分率。阴性（-）：无阳性细胞或阳性细胞数臆5%；阳性（+）：阳性细胞跃5%。1.4统计学处理：采用SPSS20.0统计软件，率的比较采用字圆检验。两变量间的相性采用Spearmen秩和相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1正常结肠黏膜组织和大肠癌组织中RKIP蛋白的表达：正常结肠黏膜组织中，RKIP定位于结肠黏膜腺上皮细胞质内，呈棕黄色，部分区域染色均一，部分区域染色聚集包膜或核膜周围，呈高表达（图1）。

结肠癌组织中RKIP蛋白阳性染色定位于癌细胞胞质内，呈淡黄色，大部分区域染色集聚在包膜周围，呈低表达（图2）。RKIP在60例正常结肠黏膜组织中阳性表达率为88%（53/60）。

RKIP在结肠癌组织中不表达或低表达。在60例结肠癌组织中，RKIP蛋白阳性表达率为48%（29/60），低于正常组织的表达。2组RKIP蛋白的表达率比较，差异有统计学意义（字2=22.182，P<0.05），见表1。2.2结肠癌组织中RKIP蛋白的表达与临床病理指标的关系：见表2。表2结肠癌组织中RKIP蛋白的表达与临床病理指标的关系RKIP蛋白表达例数性别年龄（岁）分化程度浸润深度男性女性臆5051~69逸70高分化中低分化浅层深层-311714813

10265724+12842918493++8

442512653+++9632612763字2值0.7845.4357.5638.124P值0.4230.0850.0140.009RKIP蛋白表达例数淋巴结转移有无结肠直肠有无溃疡型浸润型隆起型-311714121992213612+1221057210624++8265335242+++9364554342字2值9.3222.5463.4672.892P值0.0040.3420.2460.316生长部位脉管侵犯生长方式表1正常结肠黏膜组织和结肠癌组织中RKIP蛋白的表达组别例数正常组织607231911癌组织60311289RKIP蛋白的表达-++++++

3讨论Raf激酶抑制蛋白最初是从牛脑中提纯的一种图2RKIP在结肠癌组织中的低表达（SP免疫组织化学伊200）

图1RKIP在癌旁黏膜组织中的高表达（SP免疫组织化学伊200）9窑窑实用医技杂志20圆园年1月第2苑卷第1期JournalofPracticalMedicalTechniques，允葬灶怎葬则赠20圆园，Vol.2苑，No.1小胞浆蛋白[5]，属PEBP家族成员。PEBP是一类存在于自然界中的小分子蛋白，其蛋白家族具有高度保守性[6]，与其他任何蛋白均无明显同源性。RKIP基因定位于12号染色体q24.22，长约10kb，含4个外显子，其转录的人RKIPmRNA长1434bp，编码由187个氨基酸组成的蛋白[7]。研究证实，RKIP在多种正常组织和细胞中都有表达，在癌细胞中低表达。许多人类恶性肿瘤中，如肺癌、肝细胞癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、鼻咽癌中，RKIP蛋白的表达明显减少，并与肿瘤的转移密切相关[8]。本实验结果表明，RKIP在正常肠黏膜组织中呈高表达，明显低于癌组织的表达。此外，部分癌组织出现RKIP表达减弱甚至缺失的情况，提示RKIP的低表达可能促使肿瘤的发生。该研究结果还显示，RKIP的低表达与癌组织的分化程度相关。在高分化结肠癌中表达率远高于中低分化者。这表明，结肠癌的恶性程度越高，其RKIP的表达越低，RKIP的低表达或失活可能与结肠癌恶性程度增加相关。由此，可以推测RKIP的缺失与结肠癌的进展有关，其是预后较差的独立预测指标。本实验显示，RKIP的低表达与结肠癌组织有无脉管侵犯无明显相关性，这表明，结肠癌的转移、扩散主要通过淋巴道或直接蔓延，当癌组织浸润肌层达浆膜层后，可直接蔓延至邻近器官如前列腺、膀胱、腹膜等[9]。目前，RKIP是研究最热门的抑制恶性肿瘤侵袭转移的基因之一。其涉及到多条肿瘤相关通路，在肿瘤的发生、发展及浸润转移起重要作用。通过本实验结果，RKIP基因可能属于抑癌基因，RKIP表达上调对肿瘤细胞侵袭，转移能力有抑制作用，有望为结肠癌的治疗提供新的靶点。参考文献[1]SiegelR，NaishadhamD，JemalA.Cancerstatistics，2012[J].CA，2012，62（1）：10鄄29.[2]韩英，李世荣.大肠癌筛查方案和模式及现阶段我国筛查策略的思考[J].中华内科杂志，2010，49（9）：731鄄732.[3]Vall佴eBS，TaucP，BrochonJC，etal.Behaviourofbovinephosphatidylethanolamine鄄bindingproteinwithmodelmem鄄branes.Evidenceofaffinityfornegativelychargedmembranes[J].EurJBiochem，2001，268（22）：5831鄄5841.[4]HaganS，Al鄄MullaF，MallonE，etal.ReductionofRaf鄄1kinaseinhibitorproteinexpressioncorrelateswithbreastcancermetastasis[J].ClinCancerRes，2005，11（20）：7392鄄7397.[5]BernierI，JollesP.Purificationandcharacterizationofabasic23kDacytosolicproteinfrombovinebrain[J].BiochimBiophysActa，1984，790（2）：174鄄181.[6]BanfieldMJ，BarkerJJ，PerryAC，etal.Thecrystalstructureofhumanphosphatidylethanolamine鄄bindingproteinsuggestsaroleinmembranesignaltransduction[J].Structure，1998，6（10）：1245鄄1254.[7]HoriN，ChaeKS，MuyakawaK，etal.AhumanCDNAse鄄quencehomologueofbovinephosphatidylethanolamine鄄bindingprotein[J].Gene，1994，140（2）：293鄄294.[8]张伟，高志安，王瑞.Raf激酶抑制蛋白和上皮型黏蛋白在结肠癌中的表达及临床意义[J].中国医科大学学报，2014，43（7）：639鄄642.[9]陈杰，李甘地.病理学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2010：266.（收稿日期：2019鄄06鄄28）·消息·本刊加入“万方数据———数字化期刊群”的声明为了实现期刊编辑、出版工作的网络化，我刊现已入网“万方数据———数字化期刊群”，所以，向本刊投稿并录用的稿件文章，将一律由编辑部统一纳入“万方数据———数字化期刊群”，进入因特网提供信息服务。凡有不同意者，请另投他刊或特别声明需另作处理。本刊所付稿酬包含刊物内容上网服务报酬，不再另付。“万方数据———数字化期刊群”是国家“九五”重点科技攻关项目。本刊全文内容按照统一格式制作，读者可上网查询浏览本刊内容，并征订本刊。