高考生物PCR的过程及应用考点归纳总结
一、基础考点
1.名称：多聚酶链式反应
2.原理：DNA双链复制（DNA的半保留复制）、DNA的热变性原理
3.前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列
4.过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：会解释三个步骤
①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合；
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸再耐高温的DNA
聚合酶的作用下，根据碱基互补配原则合成新的DNA链
④重复：第一轮循环的产物作为第二轮的模板：重复循环变性—复性--延伸三过
程。
5.PCR反应体系的成分及作用
DNA模板：从样本或细胞中提取的微量总DNA
原料∶dNTP（dATP、dGTP、dCTP、TTP），提供原料和能量
酶∶Taq聚合酶（热稳定DNA聚合酶，从嗜热菌中分离得到）
引物∶一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
（注意：引物与目的DNA片段两条母链各自的3’端序列互补）
Mg2+：维持酶活性所必需
PCR缓冲液∶维持pH，保护Taq酶
6.DNA在体内复制的条件
模板∶DNA分子的每条链
酶∶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
原料、能量∶dATP、dGTP、dCTP、dTTP
引物∶RNA引物，温和的反应条件7.总结：PCR与体内DNA分子复制的不同点：PCRDNA复制
复制起点无有
复制叉无有
场所及条件体外；
控制3个不同温度体内细胞核、线粒体、叶绿体；
温和条件
步骤变性、退火、延伸起始、延伸、终止
酶Taq酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
引物2种，一小段与DNA母链的
一段碱基序列互补配对的
短单链DNA；人工合成多种RNA做引物；自行合成
引物是否去除否是
变性的条件90℃以上的高温解旋酶
结果短时间内快速扩增目的基
因片段复制完整的DNA分子
特点
半保留复制
两条链连续合成半保留复制
半不连续复制
8.PCR技术在基因工程中的应用：
测序试剂质量标准
一、目的
本标准旨在规定测序反应所需的各种酶的活性、纯度和浓度，引物、模板、dNTPs等的质量要求，测序反应的体系组成，温度和时间设置，产物质量，重复性和准确性等方面的要求。以确保测序实验的准确性和可靠性。
二、测序反应所需的各种酶的活性
1. 逆转录酶（Reverse Transcriptase）：活性应不低于2000 units/μl。
2. DNA聚合酶（DNA Polymerase）：活性应不低于5000 units/μl。
3. Taq酶（Taq DNA Polymerase）：活性应不低于100 units/μl。
三、测序反应所需的各种酶的纯度和浓度
1. 逆转录酶和DNA聚合酶的纯度应不低于95%，浓度应为1 unit/μl。
2. Taq酶的纯度应不低于98%，浓度应为10 units/μl。
四、测序反应所需的引物、模板、dNTPs等
1. 引物：应采用HPLC纯化，浓度应为100 pmol/μl。
2. 模板：应具有高纯度，浓度应在100 ng/μl以上。
3. dNTPs：应具有高纯度，浓度应为10 mM。
五、测序反应的体系组成
测序反应的体系组成应根据具体测序方法和试剂品牌进行调整，但一般应包括以下成分：
1. 酶混合液：包含逆转录酶、DNA聚合酶或Taq酶等。
2. dNTPs混合液：包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP等。
3. 引物：应根据具体测序实验需求添加。
4. 模板：应根据具体实验需求添加。
5. Buffer：测序反应所需缓冲液。
6. 去离子水：用于调整反应体系体积。
六、测序反应的温度和时间设置 测序反应的温度和时间设置应根据具体测序方法和试剂品牌进行调整，但一般应遵循以下要求：
1. 预变性：95℃ x 5分钟。
2. 退火：根据引物和模板的特性和浓度设置退火温度和时间。
3. 延伸：72℃ x 30秒 - 1分钟。
4. 变性：95℃ x 15秒。
1 第一节 基因工程及其技术
第1课时 基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术
课标内容要求 核心素养对接
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用,并能说出它们在基因工程中的应用。
科学思维：掌握PCR技术的过程与原理,并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。
社会责任：通过了解基因工程的发展历程,认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果,并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。
一、基因工程是在多学科基础上发展而来的
1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。
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1967年：罗思和海林斯基等发现运转工具质粒,同年,科学家发现DNA连接酶。
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1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。史密斯等人分离到限制性内切核酸酶。
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1972年科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。
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1973年科学家科恩领导的研究小组利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。
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接着,科恩和美国博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。
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1976年,科学家用质粒为载体,将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌,1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。
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1977年桑格测定了一种噬菌体的基因组序列,这是人类首次对完整基因组的核苷酸顺序进行测定。
二、基因工程的基本工具 2 1．基因工程
(1)概念：又称为DNA重组技术,是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA,然后导入受体细胞,并使其在受体细胞中表达,产生人类需要的基因产物的技术。
(2)原理：基因重组。
(3)操作水平：基因(分子)水平。
北京索莱宝科技有限公司
第1页共2页PCRMasterMix说明书货号：名称：规格：PC11202×TaqPCRMasterMix(含染料)1mL/1mL×5PC11502×TaqPCRMasterMix(不含染料)1mL/1mL×5PC13202×PfuPCRMasterMix(含染料)1mL/1mL×5PC13502×PfuPCRMasterMix(不含染料)1mL/1mL×5PC12202×TaqPlusMasterMix(含染料)1mL/1mL×5PC12502×TaqPlusMasterMix(不含染料)1mL/1mL×5保存：-20℃保存，有效期12个月，4℃短期保存一周，避免反复冻融。产品简介：本PCRMasterMix包含三种酶(Taq，Pfu，Taqplus)，每种酶对应着两种PCRMasterMix（含染料和不含染料），一共六种PCRMasterMix。Taq：扩增效率最高的耐热DNA聚合酶，其扩增速度约为1-2kb/min。扩增碱基出错率为10-5左右。其产物未端带有A，可直接用于TA克隆。Pfu：目前保真度最高的耐热DNA聚合酶，碱基出错率为10-6，但扩增效率低于Taq酶，一般能很好的扩增2kb以下的片段。其扩增速度约为500bp/min左右。其产物为平未端，须加A后才可用于TA克隆。TaqPlus：Taq和Pfu的等比混合物。集扩增效率高和保真度好于一身。扩增效率比Pfu高，保真度比Taq好。其扩增速度约为1000bp/min左右。其产物未端带有A，可直接用于TA克隆。含染料PCRMasterMix反应完后可以直接电泳检测。不含染料的PCRMasterMix反应完后加入上样缓冲液后电泳检测。产品组成(2×)：北京索莱宝科技有限公司
第2页共2页20mMTris-HCl(pH8.3)100mMKCl3mMMgCl2500μMdNTPeach0.1UPolymerase/μLddH2O，其它稳定剂和增强剂应用举例：1、按下面配制50μLPCR反应体系Template<1μgPrimer1(10μM)2μLPrimer2(10μM)2μL2×MasterMix25μLddH2Oupto50μL2、PCR反应循环设置94℃3min94℃30sec30cycles55℃30sec72℃500-2000bp/1min72℃5min3、结果检测：反应结束后，取5μL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。
