© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
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由于Taq DNA聚合酶是目前PCR反应体系中应用最广泛的酶，因此此文主要讨论使用该酶的PCR反应体系。
A 镁离子浓度
镁离子是热稳定DNA聚合酶的辅因子，其浓度对PCR至关重要.模板DNA的浓度，鳌合物（如EDTA和柠檬酸盐）、dNTP浓度和蛋白都会影响反应体系中游离镁离子的量.如果游离的镁离子含量不够，那么Taq DNA聚合酶则无法行使功能(figure1)。过多的游离镁离子则会降低酶的保真度，可能会增加非特异性扩增.因此，研究者应当根据实际的实验结果来优化每一反应中镁离子的浓度。可以用一系列的镁离子浓度梯度来验证，镁离子浓度范围为1～4mM，每次增加或降低0。5~1 mM。扩增产量最高，非特异性产物最低时的镁离子浓度即为最优。最优镁离子的浓度范围跟DNA聚合酶的类型相关，例如,Pfu DNA 聚合酶似乎对镁离子的依赖性更低,但其优化范围通常为2~6mM.
许多DNA聚合酶产品提供Mg—free reaction buffer和单独一管25mM MgCl2，这样就可以自行调节Mg2+浓度，优化反应体系。MgCl2溶液在反复冻融后会出现浓度分层,为获得均一的溶液，在配液的时候，要确保MgCl2溶液完全溶解并充分震荡混匀。非常简单的两步,溶解和混匀，常常会造成实验失败。
有些科学家倾向于使用包含MgCl2的buffer,MgCl2的终浓度为1。5mM.值得注意的是有文献报道发现使用此类buffer的结果并不稳定，有时体系内游离镁离子的浓度会有0.6mM的变化，如果在90℃加热10min,则结果趋于稳定，因此作者假设反复冻融的buffer中MgCl2可能会有沉淀现象发生。
Figure 1.镁离子浓度对PCR扩增的影响。用不同浓度 Mg 2+测试，产物大小为1。8kb 琼脂糖凝胶电泳,EB染色泳道M为MAKER； Lane 1， 0mM Mg 2+ ; Lane 2, 0。5mM
Mg 2+ ;Lane 3, 1mM Mg 2+ ; Lane 4, 1。5mM Mg 2+ ; Lane 5， 2mM Mg 2+ ; Lane6， 2.5mM
1 / 10 分子生物学实验报告 实验内容：设计一个完整的实验，以水稻基因组为例，最终得到纯化的一个基因片段。 2 / 10 水稻基因组DNA提取以及基因片段的扩增、纯化和检测 1.实验目的： 1.1 熟练掌握实验室分子生物学相关的仪器的规范使用方法 1.2 遵守实验室相关的实验规章制度，服从实验人员的管理 1.3 熟练掌握实验室有关植物基因组DNA的简单提取方法以及检测方法 1.4 了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握胶体制备的方法以及电泳仪的操作方法 1.5 掌握PCR技术的操作流程，熟练使用PCR仪并了解其工作原理及检测方法 1.6 了解柱纯化的原理及使用方法 2.实验原理 1）水稻叶片基因组DNA提取 水稻属于真核生物，其DNA以双链线性高分子形式存在于细胞核中，一般以染色质形式在。由于植物组细胞破裂之后，DNA酶会水解DNA因此在提取过程总要加入EDTA螯合剂从而抑制DNA酶活性。 水稻叶片基因组DNA的提取主要是通过破碎组织和细胞从而通过对细胞内其他杂质的去处来达到基因组DNA的提纯。提纯的产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检验。 本实验是通过CTAB法来进行提取的，它是一种阳离子表面活性剂，能溶解细胞膜和和核膜蛋白，使核蛋白解聚从而使DNA游离出来，已达到分离的目的。 2）特定基因片段的PCR扩增 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在95℃ 3 / 10 下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(55℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经30轮循环就可使DNA扩增上百倍。 3）PCR产物的纯化 PCR产物的纯化在本实验中是通过柱纯化的方法进行的。试剂盒吸附柱中的硅胶膜可以再高盐度的缓冲液下结合DNA，在通过低盐度的缓冲液洗脱，通过这样的纯化过程去除了除特定产物外的其他DNA样品以及各种杂质。 4）DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应来达到混合物分离的目的。DNA分子的迁移速率与其相对分子质量成反比，此外不同构型的DNA分子的迁移速率不同（cccDNA>ｌDNA>ocDNA)。通过EB染色即可在紫外灯下观察到胶体中DNA的纯度、大小等情况。 3.实验试剂和实验仪器 1）实验试剂 CTAB提取液、苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)、氯仿/异戊醇(24:1)、EDTA、异丙醇、70%乙醇；Taq 酶、PCR Buffer、引物、dNTP、ddH2O；PB、PW、EB（Elution Buffer）；西班牙琼脂糖、TAE、EB（溴化乙锭）溴酚黄、Marker。 2）实验仪器 移液器一套、离心管架、电子天平、水浴锅、微波炉、高速离心机、电泳系列设备、研钵、紫外透射仪、PCR仪、漩涡振荡器、掌上离心机、 4 / 10 3）实验耗材 配套的不同规格枪头、不同规格离心管、吸附柱、乳胶手套、PE手套以及鞋套。 4.实验步骤 1）水稻叶片基因组DNA提取及检测 a.加1mlCTAB研磨0.2g水稻叶片，时间不超过5分钟，并迅速转移300ul至2ml离心管中，再加300ulCTAB混匀后放入65度恒温水浴锅中水浴30分钟，每个5分钟混匀一次。 b.向冷却后的离心管中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，轻微颠倒混合后，室温下12000rpm离心10min。 c.取上清液体300ul转移到新的1.5ml离心管中后加入等体积的氯仿/异戊醇，轻微颠倒混合，12000rpm离心10min。 d.取上清250ul转移至新的1.5ml离心管中，加500ul异戊醇颠倒混匀，12000rpm离心10min。去上清吸干异戊醇。 e.加0.5ml70%乙醇洗涤3-5分钟，12000rpm离心10min，重复一次后将乙醇完全晾干。 f.加150ulddH2O溶解DNA。取3uL样品在1%琼脂糖凝胶电泳中检测DNA浓度和纯度。剩余样品-20度保存。 2）基因片段的PCR扩增及产物检测 a.以小组为单位配置MIX，加上阴性对照总共需配13管MIX，按实际用量的120%算后得到以下实际的加入量： 试剂名称 μl/反应 计算用量 实际用量 ddH2O 15.38 239.928 239.9 5 / 10 b.按照上面的配方用1.5ml的离心管取液，取液顺序依次为：ddH2O、PCR、Buffer、dNTP、Primer、Taq 酶（5U/μl）。 c.混匀后分装到13个标记的PCR管中，每管22ul。分装完成后再向PCR管中对应的加入6个阳性对照(3ul的标准DNA模板)、6个样品基因组（3ul）以及一个阴性对照（3ulddH2O）。 d.加完样后对离心管进行振荡离心，后放置于冰上暂存。 e.将样品以及对照组的PCR管放入PCR仪中，设定如下程序进行扩增： 95℃ 1min 95℃ 20s 60℃ 30s 30 cycles 72℃ 30s 72℃ 1min 15℃ for ever f.在扩增的过程中进行琼脂糖凝胶的制备，在得到PCR产物后加5ul的ddH2O进行稀释，后取3ul的产物按3：1的比例将样品与溴酚黄混合均匀点样，并开始电泳的过程。 g.电泳结束后对胶体进行EB染色，并在紫外仪下观察并检测PCR产物的浓度及纯度。 3）PCR产物的纯化及检测 a.向样品管中加入20ul的PCR产物，同时加入5倍体积的PB溶液，吹打均匀。 b.将混匀的液体转移到吸附柱中，静置后8000rpm离心30S，将收集管中的废液倒掉后吸干管口处液体。 PCR Buffer 2.5 39 39 dNTP 2 31.2 31.2 Primer 2 31.2 31.2 Taq 酶（5U/μl） 0.12 1.872 1.872 6 / 10 c.再向吸附柱中加入730ul的PW溶液，8000rpm离心30S，去除废液，在空甩一次后将吸附柱放入1.5ul的EP管中收集纯化产物。 d.用22ulEB溶液对吸附柱进行洗脱，静置5分钟后12000rpm离心2min，收集纯化产物。 e.用1.5%的琼脂糖凝胶对纯化的产物和未纯化前的样品进行对照电泳，检测纯化的效率。 4）琼脂糖凝胶电泳（*注：参与整个过程） a.根据基因组片段的大小配取不同浓度的胶（如基因组DNA检测时配的是1%的胶，PCR产物检测则用的是1.5%的胶）。将溶有琼脂糖的锥形瓶放入微波炉中加热煮沸，目的是使琼脂糖溶解，过程中要再煮沸时拿出来摇几下，目的是赶走胶中的气泡。 b.等无气泡后使其冷却至60度左右，将胶倒入插好梳子的平板中，过程要轻、慢，但也不能过慢防止其过快凝固。 c.待胶冷却凝固后，将其放入750ml的电泳槽中，加上缓冲液，点样。 d.打开电泳仪开关，设定好电压时间后，开始电泳。等条带跑出胶体的1/2左右时关闭电泳仪。 e.取出胶体，到暗房进行EB染色，大约10分钟，之后进行照胶观察。 7 / 10 5.实验结果及分析 1）水稻叶片基因组DNA提取 点样顺序：D2000, 11 DNA samples，Hind ⅢΛDNA 图（1）：水稻基因组DNA电泳图谱（22号泳道的样品为笔者基因组DNA的电泳结果，其中M1——D2000,M2—— Hind ⅢΛDNA） 结果分析：由上图22泳道的电泳结果可知，最上面一条带为水稻基因组DNA，大小约为23Kb左右，亮度不高说明所提的基因组DNA的浓度不够，此外在该条带下方有大片杂带区域，说明所得的样品中有很多断裂的基因以及部分RNA,分析原因可能有以下几方面： a．在研磨水稻叶片时研磨程度不够或者研磨时间过长导致基因组DNA大量降解，最终导致提取的叶片基因组DNA含量偏少，致使其浓度不够，电泳后染色所得到的条带暗淡，且有大片杂质区域。 b．提取过程中摇动的幅度过大或者因为水平摇动，导致液体产生涡流将基因组DNA片段搅断，使基因组DNA的含量降低，而断裂的DNA含量增加，杂带增加。 c．操作过程中的DNase酶的污染，使得基因组DNA降解。 d．溶解DNA时有乙醇未晾干，导致点样时样品上漂，使得电泳结果中基因组DNA浓度下降。这也可能是有些组同学在前期基因组DNA提取时无条带而后期有PCR产物的所谓“复活”现象产生的原因。 8 / 10 2）基因片段的PCR扩增 点样顺序：阳性（+）与样品间隔点样，Maker点中间，阴性（—）对照分别点在两组样品的末端 图（2）：PCR扩增的基因片段电泳图（22号泳道的样品为笔者PCR产物的电泳结果，其中22+为提供的标准的PCR产物，M——D2000） 结果分析：由上图22和22+泳道的电泳结果分析可知，通过基因组DNA 与特定引物结合并扩增的PCR产物大小在600bp左右，且条带明显，说明所得的产物浓度较高，和所提供的阳性对照组的电泳结果基本一致。但下方仍存在弥散状的小片段物质，经分析该杂质可能为引物二聚体以及少量的RNA和DNA片段。相对所给的样品来说PCR产物下方的杂带要少，这可能和引物加入量以及其他MIX成分的含量过高有关。针对目的条带下出现的杂带区域的原因分析如下： a．实验操作过程中不小心混入空气中或衣物上的小分子RNA或者DNA片段，影响实验结果的纯度。 b．在配置MIX溶液时加入的引物浓度相对过高，导致引物二聚体的大量产生，形成杂带。 此外，由于PCR的过程只需要少量的基因组DNA甚至是某些断裂的片段就可以得到高浓度的产物，所以这也可能是某些组同学在之前基因组DNA提取过程中没有或者有很淡的条带，也能得到较好的PCR产物，成功“复活”的原因之一。 9 / 10 3）PCR产物的纯化 点样顺序：PCR产物与纯化产物（c）间隔点样，Maker在中间 图（3）：PCR产物纯化前后对比的电泳图（22泳道为笔者未纯化的PCR产物电泳图，22c为纯化后的PCR产物电泳图，其中M——D2000） 结果分析：由22和22c泳道的电泳结果可知，PCR产物纯化的效果很好，产物下方所出现的弥散状杂带已基本没有，与之前的PCR产物相比较纯度大大提高。但是通过其他组的纯化后的产物观察可得，部分组纯化后的产物仍可见少量杂带（例如18c和19c），分析其原因可能有以下几方面： a．空气中或者衣物上的小分子基因片段混入点样的样品中污染样品，影响纯化效果。 b．在取样过程中纯化前样品对纯化后样品的交叉污染，或者是操作人员疏忽未更换枪头导致的等。 6.实验总结与讨论 本次分子生物学实验主要是以水稻叶片为原材料对其基因组DNA进行提取、目的片段进行扩增以及PCR产物的纯化，就几次实验结果的检测来看，整个实验还算是比较成功的。 首先是水稻叶片基因组DNA的提取。由于在大三下学期做过相关的植物基因组DNA提取试验，因此依旧记忆犹新，实验操作过程中的一些值得注意的地方都小心处理，例如：在温浴时，研磨液需要每个5min左右摇动一次，由于此 10 / 10 时DNA处于溶解状态，所以摇动时要注意上下颠倒，避免产生涡流而导致基因组DNA的断裂，同时在溶解DNA后也要注意摇匀时要上下颠倒，因此最终得到了较为理想的实验结果。 其次是目的片段的PCR扩增。在PCR扩增的过程中最关键的步骤是MIX的配制，过量的引物会产生大量的引物二聚体，过量的dNTP、Taq酶也会造成弥散的杂带出现，因此合理的PCR体系十分关键。 最后就是PCR产物的纯化。这步实验主要是通过试剂盒操作的，所以总体来说较简单。但是需要避免点样过程中的交叉污染造成纯化后结果不理想的情况。 针对实验过程中其他小组所出现的阴性结果、“复活”现象讨论如下： 在做基因组DNA提取检测的结果中13、15组基本属于阴性结果，在相应位置几乎看不到基因组DNA的电泳条带。相反，13组有大量分布弥散的区域，很有可能是其在提取基因组DNA过程中应操作失误而是样品大量断裂，最终形成阴性结果。而15组除了没有基因组DNA外，其他杂带区域也基本没有，很有可能是在提取过程中操作严重失误导致样品完全丢失，或者是点样时样品没有点到孔中造成的。 然而在PCR产物的电泳结果图中， 15组依旧没有任何目的条带，只有底部出现由于引物二聚体存在而导致的亮斑，说明15组提取样品中的确没有基因组DNA。而13组出现了浓度较高的产物，即“复活“现象，而这个现象可以分以下几种情况来解释： a．13组样品的基因组DNA含量较少加上点样时的失误造成最终电泳结果出现假阴性，但是由于PCR的灵敏度高，因此在PCR扩增后产物浓度依然能达到一定高度，所以成功“复活“。 b．13组样品中的确不含有基因组DNA，但是由于断裂片段中可能含有该引物所能扩增的完整片段所以，在PCR过程中依旧可以得到较好的PCR产物，形成假阳性的现象，从而得以“复活”。 c．13组样品中含有基因组DNA但是由于用乙醇洗涤是乙醇没有晾干，导致溶解的DNA溶液中含有乙醇，点样时造成样品上漂，造成了假阴性的结果。
质粒扩增步骤
一、引言
质粒扩增是分子生物学中常用的技术之一，其基本原理是利用PCR技术对质粒进行扩增，从而得到大量的目标DNA。本文将介绍质粒扩增的步骤及相关注意事项。
二、实验前准备
1. 质粒提取：从菌落或液体培养物中提取质粒，可采用化学法或机械法等方法。
2. DNA纯化：将提取得到的质粒进行纯化，去除杂质和副产物。
3. DNA定量：使用分光光度计或荧光定量仪等设备对DNA样品进行定量，确保扩增反应中所需的DNA浓度。
4. 引物设计：根据目标DNA序列设计引物，确保引物与目标DNA序列匹配度高，并且不会与其他非目标序列发生交叉杂交。
5. PCR试剂准备：制备PCR反应体系所需的试剂和缓冲液等。
三、PCR反应步骤
1. 取出PCR试管，并在其中加入以下试剂：
(1) 模板DNA：一般情况下，每个反应需要添加10-100 ng模板DNA。
(2) 引物：通常需要添加两个引物，浓度一般为0.1-1 μM。
(3) Taq DNA聚合酶：添加适量的Taq DNA聚合酶。
(4) PCR缓冲液：根据PCR试剂盒说明书中的配方加入适量的PCR缓冲液。
(5) dNTPs：添加适量的dNTPs，通常为0.2 mM。
2. 放入PCR仪中进行扩增反应：
(1) 初始变性：将反应体系放入PCR仪中，在95℃下变性模板DNA，使其单链形成双链DNA，时间一般为2-5分钟。
(2) 循环扩增：在变性后，将温度降至50-60℃左右，让引物与模板DNA结合。然后升温到72℃左右，启动Taq DNA聚合酶活性，开始扩增反应。每个循环周期包括三个步骤：
① 变性：95℃下变性模板DNA；
② 引物结合：50-60℃下让引物与模板DNA结合；
③ 扩增：72℃下启动Taq DNA聚合酶活性进行扩增。
循环周期数一般为25-40次。
(3) 终止扩增：完成循环扩增后，在72℃下再保持10分钟左右，使Taq DNA聚合酶活性完全终止。
