一文讲清qPCR（荧光定量PCR）的Ct值
做qPCR不可能不知道Ct值。直到现在，所有做qPCR的童鞋们，都认为Ct值就是荧光定量PCR的YYDS。
真的是这样吗？大家慢慢分析吧，可以未雨绸缪的关注一下。
我在之前的长文中讲到，对qPCR有三阶认识，如果还没有看过的，出门左转-右转-向东-向西-向南-向北，最后点击下面的链接。
不出所料，你必须掉头，再也不回来，因为文章在万里里有点长。
今天我们要说的问题，也是对qPCR的更高阶的认识。
1、Ct值到底是不是YYDS？
2、Ct值跟哪些因素有关？
3、同样的模板，Ct值大试剂盒就差吗？要不要换试剂盒？
先从这张盗版图说起。你必须了解以下概念和问题。
Ct值-阈值-基线
1、阈值循环数（Cycle threshold，Ct值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。这就是荧光定量PCR的理论基础。 2、阈值怎么确定呢？阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。为什么是10倍，而不是5倍8倍？就是为了和基线拉开距离，证明PCR扩增进入指数扩增期。为什么不是20倍30倍？因为每个一PCR循环都会放大误差，而此时误差还未被放大。我们当然可以把阈值设置到30个循环，但是30个循环以后，扩增效率和其它误差带来的数据偏差，估计他妈妈都不认识了。
3、基线又是怎么确定呢？基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号，同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。
很显然，基线一变，阈值就改变了，阈值改变，Ct值就跟着改变。由于每次实验的样本和仪器，甚至混合情况不一样，使得基线有所差异，最终会影响Ct值。所以拿上一次实验的样本去检测本次实验的Ct值是否一致，本身就是刻舟求剑，没有可比性，所以童鞋们应该明白了，为啥qPCR一做就要放在一起做，就是这个原因。
聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经
PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。
实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。
实时荧光定量 PCR是目前确定样品中DNA (或 cDNA) 拷贝数最敏感、最准确的方法。
Real-Time PCR and Conventional PCR
常规 PCR Process
In theory, product accumulation is proportional to 2n, where n is the number of amplification
cycle repeats
Reality vs. Theory
Amplification is exponential, but the exponential increase is limited:
-A linear increase follows exponential
-Eventually plateaus
常规PCR方法的局限性分析：
-无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析
-必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒
-无法对扩增反应实时检测
定量的最佳时期
Quantitative information comes from monitoring
taqman荧光定量pcr步骤
TaqMan 荧光定量 PCR（Real-time Quantitative PCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测特定核酸序列的表达水平。以下是一般的 TaqMan 荧光定量 PCR 实验步骤：
1. 设计引物和探针：根据目标基因序列，设计合适的引物和
TaqMan 探针。
2. 准备模板：提取待测样本的 DNA 或 RNA，并将其作为模板用于 PCR 反应。
3. 反应体系准备：根据试剂盒说明书，准备反应体系，包括反应缓冲液、引物、探针、dNTPs、Taq 聚合酶等。
4. 设定反应条件：根据引物和探针的特性，设置合适的 PCR 反应条件，如温度、时间等。
5. 加样和运行 PCR：将准备好的反应体系和模板加入 PCR 仪中，开始运行 PCR 反应。
6. 数据采集和分析：在 PCR 反应进行过程中，仪器会实时监测荧光信号，并记录每个循环的荧光强度。根据荧光强度与循环数的关系，绘制荧光定量曲线，并进行数据分析。
7. 结果解读：根据荧光定量曲线和标准曲线，计算出目标基因的初始拷贝数或相对表达量。
taqman荧光定量pcr基本原理
TaqMan荧光定量PCR是指采用荧光标记的PCR技术，它可以实现对特定序列DNA的定量分析，即可以直接测量所检测序列在模板文库中的相对浓度。TaqMan荧光定量PCR可以说是一种双通道的实时PCR技术，最初由PE Applied Biosystems（PE）推出。它是通过特定的标记技术，开发了FRET和TaqMan技术，结合PCR技术，以达到定量分析和监测某一特定序列DNA的目的，这种技术比以往的技术有很大的优势，更易于完成。
TaqMan荧光定量PCR的基本原理比较简单，大致可以分为以下四步：
（1）样本处理：检测序列DNA及其作为模板的原始样品将在定量PCR试剂盒中经过一系列处理，得到模板文库。
（2）探针标记：样品处理完成后，将开发出一对对应该特殊序列的5'荧光探针—特殊碱基对相对应的序列和3'分子耦合（MolecularBeacon）。探针内部具有双螺旋结构，当处于开放状态时，荧光物质才能折射发射自己特有的颜色荧光。
（3）反应物添加：在模板文库中添加进Taq DNA 聚合酶、核酸类型的合成引物，以及缓冲液，用水调节总体浓度。
（4）加热-冷却：完成上述步骤，将反应液放入定量PCR仪，按照一定的条件，经由一系列的加热、冷却过程，Taq DNA聚合酶将碱基对引物合成，产生复制模板文库。同时在复制过程中，反应液中复制数量也不断增加，一旦达到一定温度，则表明文库复制到足够多，荧光探针能够在反应液中爆炸，产生光谱，得以直接测定检测序列DNA的定量。
此外，TaqMan荧光定量PCR技术能够检测DNA的扩增曲线，并由此提供准确的定量结果，同时也不受PCR技术的一些影响，更易于操作。
