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《分子生物学试验》课程教学大纲课程编号： 05030适用专业：生物工程与生物技术试验学时数：36学时试验学分：1教材：主要参考书：《分子生物学试验指导》徐庆华等成栋学院立项教材 2024一、课程说明《分子生物学试验》以介绍分子生物学中的试验方法、试验手段和培育学生试验操作技能为其主要内容。
须要以分子生物学基本理论为基础，其教学目的是为了提高学生在分子生物学技术方面的动手实力，培育学生分析问题和解决问题的实力。
通过试验，要求学生能在原有的相关理论学问基础上较全面和深化理解分子生物学基本原理，驾驭基本的分子生物学试验方法和技巧，初步具备肯定的试验设计实力，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。
本试验课在方法上力求经典，试验内容涉及了质粒DNA的提取及限制性内切酶酶切质粒分析；大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化大肠杆菌；应用多聚酶链式反应（PCR）体外基因扩增及产物鉴定；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量等分子生物学的基本理论。
二、学时安排三、教学内容及教学基本要求试验一碱裂解法小量提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳检测一、试验特点试验类型：综合试验类别：专业基础安排学时：6 每组人数：2二、试验目的1、驾驭碱裂解法小量提取质粒DNA和试剂盒提取质粒DNA的原理和方法。
2、驾驭琼脂糖凝胶的制备及外源DNA的检测原理。
3、了解质粒DNA的粗略定量方法。
三、试验内容提要1、将单菌落接种于3m1含相应抗生素的LB培育基中，37℃摇菌过夜；2、12,000rpm离心30sec，收集菌体；3、加200u1溶液I(含RNaseA 100ug/ml )，振荡悬浮菌体；4、加200ul新配制的溶液II，颠倒混匀；5、溶液澄清后马上加入预冷的200u1溶液III混匀后冰上放置5~10 min；6、4℃、12,000rpm离心15min，取上清，加0.7倍异丙醇混匀，室温静置5min；7、12,000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量水或TE，-20℃保存备用。
基础实验技能培训实验操作手册2014-08植物基因组DNA提取实验材料：植物样本，植物基因组DNA提取试剂盒，β-巯基乙醇，氯仿，无水乙醇实验仪器、耗材：移液器、电泳仪、离心机、研钵、研钵棒、剪刀、天平、液氮实验前准备：1．Buffer GP1在使用前请加入β-巯基乙醇，5 ml Buffer GP1加5 μl β-巯基乙醇。
加入β-巯基乙醇的Buffer GP1室温可保存1个月。
2．预热水浴锅65度，将加入配制好的巯基乙醇预热。
3．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
4．称取植物样本约100 mg。
5．在研磨植物材料前，向研钵中倒入酒精，放入剪刀、钥匙高温消毒。
6．研钵、剪刀、钥匙冷却后，将液氮加入在研钵中以预冷研钵。
实验步骤：1. 取植物新鲜组织约100 mg，用剪刀将样本剪碎，放入研钵，加入液氮充分研磨至粉末状。
将粉末转移到离心管中。
注意：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。
而且粉末应在化冻前转移，否则内源性DNase 有可能降解基因组DNA。
2. 加入700 μl 65℃预热的Buffer GP1（Buffer GP1在使用前请加入β-巯基乙醇，5 ml BufferGP1加5 μl β-巯基乙醇），迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管混匀样品数次。
3. 加入700 μl 氯仿，充分混匀，12,000 rpm（～13,400×g）离心5分钟。
小心将上层水相转入一新的离心管中，加入700 μl Buffer GP2，充分混匀。
4. 将上步所得溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column DM）中。
若一次不能加完溶液，可分多次转入。
10,000 rpm（～11,500×g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
分子生物学基础实验实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理载体:要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。
载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。
作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA 链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。
细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb 之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。
每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。
通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。
小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。
在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。
igem 高中组往年获奖项目介绍摘要：1.简介a.什么是iGEMb.iGEM高中组的比赛概述2.往年获奖项目介绍a.2017年项目：利用合成生物学改进绿脓杆菌的生物发光性能b.2018年项目：构建一个用于检测水体中抗生素残留的生物传感器c.2019年项目：利用基因编辑技术提高植物抗病性和生长速度d.2020年项目：开发一种基于细胞的生物计算机3.项目特点与成果a.涉及前沿生物技术b.紧密结合社会实际需求c.学生自主研究、实践和合作4.对我国青少年科学教育的启示a.培养学生的创新意识和实践能力b.激发学生对科学的热情和兴趣c.加强跨学科、综合性的教育模式正文：iGEM（国际遗传工程机器设计竞赛）是一项面向全球大学生的合成生物学竞赛，旨在推动生物学技术创新和发展。
近年来，iGEM高中组也吸引了越来越多的学生参与。
本文将介绍一些往年iGEM高中组的获奖项目，以及它们的特点和成果。
在2017年的比赛中，一支团队利用合成生物学技术改进了绿脓杆菌的生物发光性能。
通过引入外源基因和优化表达条件，他们成功地提高了绿脓杆菌的生物发光强度，为生物发光技术在实际应用中的发展提供了新思路。
2018年，另一支团队构建了一个用于检测水体中抗生素残留的生物传感器。
该传感器基于重组酶介导的信号放大技术，可以在水样中检测到微量的抗生素，为水环境保护提供了有力的工具。
2019年，iGEM高中组项目中，有团队利用基因编辑技术提高植物抗病性和生长速度。
他们通过设计特异性识别和切割病原菌DNA的CRISPR/Cas系统，实现了对植物病害的有效防治。
同时，通过编辑植物生长激素相关基因，他们还提高了植物的生长速度，为农业生产提供了新的解决方案。
在2020年的比赛中，有团队开发了一种基于细胞的生物计算机。
该生物计算机利用细胞内的信号传导网络进行信息处理和运算，为未来生物计算领域的发展提供了新方向。
这些获奖项目体现了iGEM高中组的同学们对前沿生物技术的掌握和应用，以及对社会实际需求的关注。
《分子生物学》讲稿课程简介课程编号：总学时数：80 周学时:6开课学期：第7学期学分：5本课程是生物科学专业一门重要的专业基础课，主要内容是通过对分子生物学的基本概念、基本理论和基本技能进行系统的阐述，注重学科体系的建立和发展过程，以DNA的结构及功能为主线，以基因表达及调控为视点，加大利用科学实验理解分子生物学概念和理论的内容，把基础知识和前沿技术有机地结合在一起。
考试方式：闭卷考试预修课程：生物化学、细胞生物学教材：现代分子生物学（第三版），朱玉贤等(注：为专科学习时采用的教材)Gene VIII （Benjamin Lewin主编）(注：为接本时的补充教材)教学参考书：1 ．Molecular Biology of the Cell (4th Edition by B Alberts)2．Molecular Cell Biology (4th Edition by H Lodish)3．Molecular Biology (2nd Edition by R Weaver)4．分子生物学(Instant Notes in Molecular Biology, 2nd Edition by P Turner）5．Advanced Molecular Biology (by R Twyman)6. 分子细胞生物学（第二版），韩贻仁，山东大学出版社7. Genomes 2, T. A.布朗著，袁建刚等译，科学出版社学时分配表理论课65学时章次内容学时一绪论 3二 DNA是遗传物质 3三 DNA的结构 3四 DNA复制和分子杂交 6五基因突变和修复8六遗传重组 8七基因组及基因作图8八基因转录和RNA加工 9九蛋白质合成 6十基因表达调控 9《分子生物学》理论课程内容课程要求: 按照知识点进行介绍;不拘泥于形式;互相学习，可以随时打断，随时质疑;要求能够在掌握一些知识的情况下熟悉分子生物学的基本原理和技术;要能够提出问题和建议;能自己进行实验设计和结果分析1 绪论［基本要求］通过本部分的学习，学生应对分子生物学的主要研究内容有一个全面系统地了解，对分子生物学的主要研究对象（基因、基因组、染色体）有一个全面的了解。
目录引物设计 (2)质粒小提试剂盒简明步骤(TIANGEN) (3)聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因 (8)三、琼脂糖核酸电泳琼脂糖核酸电泳琼脂糖核酸电泳 (12)PCR扩增产物纯化（纯化试剂盒TIANGEN） (15)琼脂糖凝胶回收DNA（胶回收试剂盒TIANGEN） (17)PCR扩增产物与Pet-28载体的双酶切与连接 (21)E.coli感受态细胞的制备与转化（化学法） (24)重组蛋白的原核诱导表达 (27)SDS-PAGE检测 (28)大量表达 (30)包涵体变性及亲和层析复性方法 (31)蛋白纯化 (32)WESTERN BLOT 实验方案 (35)透析 (41)引物设计可遵循下列原则：（Primer 引物搜索，Oligo 6引物评价）①引物长度：引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，太短影响引物与模板的配对但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
②四种碱基随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，这样易导致错误引发（false priming）；③引物中G+C含量：通常为40-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度——Tm＝4(G+C)+2(A+T)，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应；④引物3’端：关键碱基，必须与模板完全配对，最好对应密码子的第一或第二位核苷酸，以减少由于密码子摆动产生的不配对。
⑤引物内部：尤其在3’端，避免存在发夹结构（Hairpin）、二聚体（Dimer）；⑥两引物之间：尤其在3’端，不能互补以防出现引物二聚体（cross dimer），减少产量；两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性；引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物5’端：对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。
分子生物学实验设计田益夫（2013141241072）唐子林（2013141241127）（一）实验目的获得发绿色荧光的细菌。
（二）实验概述通过体外扩增目的基因eGFP并构建表达载体pET-28a-eGFP转入大肠杆菌BL21，涂板观察细菌中外源绿色荧光蛋白基因表达情况。
（三）实验步骤及材料1 实验准备与质粒提取1.1 实验材料及试剂含有pEGFP-N3质粒的大肠杆菌菌液和含有pET-28a质粒的大肠杆菌菌液（或pEGFP-N3质粒、pET-28a质粒及E.coli DH5α）；胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂，去离子水，1N NaOH；溶液I, 溶液II, 溶液III;卡那霉素储存液（50mg/ml），工作浓度50μg/ml;氨苄青霉素储存液（100mg/ml）,工作浓度100μg/ml；饱和酚，氯仿，异戊醇；无水乙醇，含RNase的双蒸水。
1.2 实验仪器恒温摇床，超净工作台，高温灭菌锅，10、200、1000μl移液器各一支及对应枪头各一盒，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器，EP管，三角瓶等常用玻璃仪器，琼脂糖凝胶电泳仪等。
1.4实验具体步骤1.4.1 仪器准备与培养基的配置（1）取两个250ml锥形瓶，各配置100ml固体/液体LB培养基，（2）按照体系将以上物品分别加入两个烧杯中，加入80ml去离子水混匀溶解。
加入琼脂的培养基在石棉网上加热溶解。
（3）用1N NaOH调节PH至7.5，倒入250ml锥形瓶中，与装好的平板一起放入高温灭菌锅内121℃灭菌20min。
（4）将包好的平板，枪头（10、100、1000μl），EP管，三角瓶等常用仪器放入高温灭菌锅内121℃灭菌30min。
（5）将灭菌后的常用仪器放置于干热灭菌箱内保存备用。
（6）取一支200μl移液枪，200μl枪头一盒，灭菌后的培养基、灭菌后的平板等放于紫外灯下照射30min。
（7）待培养基降温至50℃左右，各加入Kana霉素10μl。
igem测试题
IGEM测试题可能涉及多个领域，包括生物学、化学、工程学等。
以下是一些可能的测试题：
1. 生物化学类题目：
在生物化学实验中，常常需要用到各种试剂。
下列试剂中，不能用于鉴别细胞是死是活的是（）
A. 荧光染料
B. 碘液
C. 荧光显微镜
D. 死细胞对染料的通透性
下列哪个选项是用于测量生物样本中DNA浓度的最常用方法？
A. 分光光度法
B. 离心法
C. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
D. 琼脂糖凝胶电泳
2. 工程学类题目：
在生物工程中，常常需要设计和优化生物反应器。
下列哪个参数是生物反应器设计时需要考虑的重要因素？
A. 反应器体积
B. 反应器形状
C. 反应器材质
D. 反应器内温度
在生物工程实验中，常常需要用到各种仪器。
下列仪器中，不能用于测量细胞密度的是（）
A. 血球计数板
B. 分光光度计
C. 流式细胞仪
D. 荧光显微镜
3. 生物学基础知识题：
在基因工程实验中，通常需要用到载体来转移DNA片段。
下列哪个选项不是载体的类型？
A. 质粒
B. λ噬菌体
C. T4噬菌体
D. 真核细胞
下列哪个选项是基因表达调控的主要机制？
A. DNA甲基化
B. DNA去甲基化
C. RNA干扰
D. 表观遗传修饰
请注意，以上题目仅为示例，IGEM测试题的难度和范围可能会根据具体的课程和考试要求而有所不同。
因此，建议查阅相关教材或咨询专业教师以获取更准确的信息。
分子生物学实验设计基础
ECUST
Light harvester iGEM 2017 present
For team SUIS_Alpha_Shanghai
摘要
基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段
目录
第1章前言 (4)
1.1 实验目的和背景 (4)
第2章实验流程和原理 (5)
2.1 实验流程 (5)
2.2 实验原理 (5)
2.2.1 外源DNA和载体的获取 (6)
2.2.2 外源DNA和载体的酶切和连接 (6)
2.2.3感受态细胞的制备和转化 (7)
2.2.4 转化子的培养和扩增 (7)
第一章前言
1.1 实验目的和背景
基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行剪切重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
因此，供体、受体、载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体而言，来自供体的基因属于外源基因重组剪接的载体也都是DNA分子，因此基因工程亦称为重组DNA 技术。
另外，DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆技术。
第二章 实验流程和原理
2.1 实验流程图
2.2 实验原理
2.21 外源DNA 和载体的获取
首先通过模板基因组获取目的基因，主要通过PCR 的方法：
PCR 技术的基本原理类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
其次通过碱裂解法获取质粒：
质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，为双链、闭环的DNA 分子，并以超螺旋状目的基因的获取 PCR 扩增 琼脂糖凝胶电泳验证 PCR 产物纯化，琼脂糖凝胶电泳验证 碱裂解法抽提质粒
PCR 产物与质粒双酶切
目的基因与质粒连接 连接液转化，抗性筛选 菌落PCR 验证
阳性，提交测
序 蛋白表达
态存在于宿主细胞中，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，其还有一些重要的性质如自主复制性、不相容性、携带遗传标记、可转移性、具有多克隆位点等。
质粒DNA的抽提主要有碱裂解法和沸水浴法。
碱裂解法主要采用了3种试剂：solµtion I由葡萄糖、EDTA、Tris-Cl组成，葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA；EDTA的作用是络合掉Mg2+等二价金属离子，防止核酸酶对质粒DNA的降解作用；Tris-Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH；使用前需加RNase I,降解细胞破碎物中RNA。
Solµtion II由SDS和NaOH组成，SDS作用是溶解细胞膜并与蛋白质结合使之变性；NaOH可以破坏氢键，使DNA分子变性，染色体DNA被组蛋白包裹着沉淀下来，同时有降解RNA和破壁的作用。
Solµtion III由KAc与HAc组成，高盐溶液能使蛋白质盐析，其PH5.5能中和solµtion II的碱性并使质粒DNA复性，K"与SDS形成溶解度很小的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。
溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS复合物形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。
然后再用乙醇沉淀DNA并以水或Elµtion bµffer溶解即可得到质粒DNA溶液。
DNA凝胶电泳分析：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
2.22 外源DNA和载体双酶切与连接
基因工程的第一步就是将目的DNA片段从不同来源的DNA上切下，并在载体分子上打开与之相对应的缺口，然后两者能连接成重组DNA分子，而完成切割操作的就
是限制性核酸内切酶。
限制性内切酶一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株（品系）。
例如，从Bacillµs amyloliqµe faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindⅡ、HindⅢ，HpaI、HpaⅡ，MboI、MboⅡ等。
根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type Ⅱ）及第三型（Type Ⅲ）。
II类限制性核酸内切酶是一种分子量较小的单体蛋白，其dsDNA的识别和切割活性仅需要Mg2+且一般识别4-8个碱基的回文序列，切割后产生3种末端：3’粘性末端、5’粘性末端或平头末端。
那么若用能产生相同粘性末端的同种限制酶或同尾酶分别切割外源DNA和质粒分子，两者的酶切片段便可在连接酶的催化下连接。
T4DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键。
可接双链DNA的平末端、相容粘末端及其中的单链切口，在分子生物学中有广泛的应用。
一般情况下，互补性粘性末端连接其载体DNA和外源DNA的分子数之比为1：3-1：10之间，这样可以有效防止载体片段自连接。
同时，为了最大限度抑制质粒的自身环化，还可将载体DNA的5’磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，而带5’磷酸的外源DNA 片段可有效地与去磷酸化的载体相连接，产生一个带两个缺口的开环分子，在转入受体菌后该种缺口可在DNA复制过程中自动修复。
2.23 感受态细胞的制备与转化
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
2.24 转化子的培养与扩增
转化子在一定的选择培养基上培养扩增，随后挑取单克隆继续培养扩增，此即为转化子的培养和扩增。
此步骤的主要目的包括：达到初步筛选的目的，即只有含载体的转化子能够在此选择培养基上生长；扩增到一定的菌数以满足后续的筛选和鉴定操作需要；挑取转化子的单克隆，以便重组子的鉴定和外源基因表达分析。
