半抗原偶联

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介Last revision date: 13 December 2020.常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。

氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。

2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。

3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。

4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。

碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液）4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、4度搅拌12小时7、静置10小时（4度）8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。

孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。

关于半抗原偶联载体的方案人工抗原的合成是化学免疫的重要问题，化学免疫研究的对象，除上面提及的药物、毒物、激素外，还有多糖类、神经递质、肽类、核酸及生物体内其它小分子活性物质，总起来说，它们大多都是无免疫原性的半抗原，在对其进行免疫学及其它相关研究时，一方面要通过化学合成的手段，即蛋白质连接技术，经与载体蛋白交联合成制备人工抗原，继而用其免疫动物制备相应的抗体或单克隆抗体，作为研究用的探针；另一方面还必须将此探针用各种标记物进行标记，如本文论及的酶标记，以便用作研究工具；在分子生物学研究中，包括核酸或基因探针的研究及应用，多种类型探针的标记也都将涉及蛋白质连接技术。

半抗原分子量一般较小，其结构及化学功能团的性质多种多样，数量各不相同，在与酶蛋白或载体蛋白进行交联时，必须考虑交联双方的性质、交联剂、交联方法和载体.2．混合酸酐法制备G6PDH(葡糖—6—磷酸脱氢酶)标记利多卡因(Lidocaine．Li)结合物[29] (1)Li—混合酸酐的制备首先将Li经化学修饰(琥珀酸酐法，略)，在其分子中引入羟基(一COOH)，制成Li—COOH(Li一琥珀酸半酯)；然后，将此Li—COOHl0mg(0．0285mm0l)溶于375ul的DMF中，用电磁搅拌混溶。

在一10℃条件下，边搅动边滴入21ul的三乙胺，再缓慢滴入14ul的卡必醇氯甲酸酯，于一10。

C继续搅拌反应1．5小时，此全部过程应保持无水，即获得Li—混合酸酐(Li—MA)。

3．(2)酶——底物溶液的制备在冰浴中，将G6FDH(L．m)lmg用50mmol／LpH8．1Tris—HCl 溶解，同时加入G6P—Na(葡糖—6一磷·酸钠盐)10mg及NADH 3mg(底物一辅酶系统，用于保护酶活性)，使其溶解，随后缓慢加入300ul卡必醇，用2m0l／LNaOH调pH至9．0。

4．(3)G6PDH—Li的交联将酶—底物溶液置于冰浴中，在搅拌条件下，每隔10~15分钟向此酶液中缓慢加入一定量(25ul，50ul，100ul……)的Li—MA溶液，反应10~15分钟后，分别取出反应液5u1测定酶活性及Li半抗原的抗体对标记酶活性的抑制率.直至加入Li—MA的量所引起酶活性的下降程度最低，而抗体对酶活性的抑制率又最高时，此标记过程即完成(表2—8)5．表2—8 G6PDH—Lidocaine交联反应中酶活性变化及抗体抑制率3.碳化二亚胺法(EDC)制备人工抗原4.最近几年，在对无免疫原性小分子物质的化学免疫研究中，采用碳化二亚胺作为交联剂制备合成人工抗原的工作愈来愈多，因为用这种试剂进行交联最为方便，除交联的一方作为载体的蛋白质，具有多个氨基或羧基外，不少小分于化合物也具有此反应基团，或通过化学修饰引入羧基。

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。

氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。

2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。

3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。

4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。

碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。

孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。

半抗原的作用嘿，朋友们！今天咱们来聊聊半抗原这个神奇的东西。

你可别小看它，虽然它就像魔法世界里那些不起眼的小魔药，但是作用那可大着呢！半抗原就像是一个调皮的小捣蛋鬼，自己单独的时候，力量有限得很，就像一个光杆司令，没有自己的军队。

它的分子小得可怜，就像一颗迷你的小星星在庞大的免疫系统宇宙里闪烁，似乎很容易被忽视。

不过，一旦这个小不点找到它的“大靠山”，那就不得了啦。

它就像一个小喽啰搭上了超级反派的战车。

半抗原可以和一些大分子结合，这个时候它就像一个小刺客找到了自己的隐身披风，借着大分子的掩护，开始在身体里兴风作浪。

对于免疫系统来说，半抗原和大分子结合后的这个复合物就像一个伪装成好人的坏蛋。

免疫系统看到这个复合物，就像一个警惕的保安看到了一个拿着奇怪包裹的陌生人，一下子就紧张起来啦。

免疫系统会调动各种防御力量，就像召集一群超级英雄来对付这个突然出现的威胁。

半抗原还像一个狡猾的小骗子。

它引起的免疫反应有时候就像一场闹剧，免疫系统被它骗得团团转。

身体里就像突然爆发了一场小战争，各种免疫细胞忙得不可开交，就像一群消防员在到处灭火。

但是从另一个角度看，半抗原也像是一个提醒免疫系统锻炼身体的小教练。

它的存在让免疫系统时不时地来一场演习，让免疫细胞们保持警惕，就像士兵们经常进行军事演练一样。

如果没有半抗原时不时地捣捣乱，免疫系统可能就会变得懒散，就像一个天天睡懒觉的大懒虫。

而且半抗原在医学研究里，那也是一个潜力无限的小明星。

科学家们研究它的时候，就像探险家在挖掘宝藏。

它就像一把神秘的小钥匙，说不定能打开治疗很多疾病的大门呢。

也许有一天，我们会发现半抗原能像魔法棒一样，把那些难治的病都给治好，那可真是太酷啦！它还像一个小小的信号弹，在身体这个复杂的战场上，一旦它和大分子结合引发反应，就像信号弹升空，告诉免疫系统哪里出现了问题。

然后免疫系统就可以根据这个信号，精准打击那些隐藏的“敌人”。

总之，半抗原虽然小得像个芝麻粒，但它在我们身体的大舞台上，却能演出一场又一场精彩又夸张的大戏，对我们的健康有着不可忽视的影响呢。

关于半抗原偶联载体的方案早上起来，一杯咖啡，看着窗外的阳光，心情大好。

今天要写的方案是关于半抗原偶联载体的，这个课题我已经研究了10年，是时候把我的思考整理出来了。

我们得明确半抗原偶联载体的概念。

简单来说，就是将半抗原和载体结合起来，形成一种新的免疫原，用于制备抗体或疫苗。

这个过程涉及到生物化学、分子生物学和免疫学等多个领域，所以方案要尽量全面，又要突出重点。

一、方案背景1.1半抗原概述半抗原，顾名思义，就是只有抗原性而没有免疫原性的物质。

它不能单独引起免疫反应，但可以与载体结合，形成免疫原。

常见的半抗原包括药物、糖类、多肽等。

1.2载体概述载体是具有免疫原性的物质，能够与半抗原结合，形成免疫原。

常见的载体有蛋白质、多聚糖、脂质等。

1.3半抗原偶联载体研究意义半抗原偶联载体在疫苗研发、抗体制备等领域具有广泛的应用前景。

通过半抗原偶联载体，我们可以提高抗原的免疫原性，降低副作用，提高疫苗的疗效。

二、方案目标2.1筛选合适的半抗原和载体2.2优化偶联方法，提高偶联效率2.3评估偶联载体的免疫原性2.4探索偶联载体在疫苗研发和抗体制备中的应用三、方案实施3.1半抗原筛选3.1.1收集文献，整理半抗原候选物质3.1.2分析候选物质的抗原性和免疫原性3.1.3筛选出具有潜在应用价值的半抗原3.2载体筛选3.2.1收集文献，整理载体候选物质3.2.2分析候选物质的免疫原性和生物相容性3.2.3筛选出具有潜在应用价值的载体3.3偶联方法优化3.3.1分析现有偶联方法的优缺点3.3.2设计新型偶联方法，提高偶联效率3.3.3对比实验，验证新型偶联方法的优越性3.4免疫原性评估3.4.1制备偶联载体3.4.2检测偶联载体的免疫原性3.4.3分析免疫原性结果，优化偶联载体3.5应用研究3.5.1疫苗研发3.5.2抗体制备3.5.3产业化推广四、方案进度安排4.1第一阶段：半抗原和载体筛选（1-3个月）4.2第二阶段：偶联方法优化（4-6个月）4.3第三阶段：免疫原性评估（7-9个月）4.4第四阶段：应用研究（10-12个月）五、预期成果5.1筛选出具有潜在应用价值的半抗原和载体5.2优化偶联方法，提高偶联效率5.3成功制备具有免疫原性的偶联载体5.4探索偶联载体在疫苗研发和抗体制备中的应用前景这个方案的实施需要团队的共同努力，大家一起加油，争取早日取得突破性成果！注意事项一：半抗原筛选的准确性解决办法：筛选半抗原时，一定要仔细分析文献，避免遗漏任何可能的候选物质。

如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到【摘要】用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。

利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。

【关键词】雷公藤内酯醇；14位羟基修饰；人工抗原；多克隆抗体雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。

长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。

近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。

除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。

近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。

但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。

细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。

作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。

为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。

蛋白质连接技术主编洪孝庄孙曼霁编著者洪孝庄孙曼霁龚雄麒仲伯华沈倍奋陈泮藻李春海卢秀桂何云汉中国医药科技出版社．前言随着生物医学研究的迅速进展，在其相应的研究领域中也显现许多新颖的应用技术，蛋白质连接技术即是其一。

蛋白质连接技术的显现最先是在本世纪20年代，在化学免疫研究中，第一次合成人工抗原时已开始利用。

尔后，在免疫学研究中，专门是在免疫标记技术中广为应用并迅速进展。

从40、50年代的免疫荧光技术，60年代的放射免疫技术，到70年代的酶免疫技术，及在此前后显现的发光免疫技术、胶体金免疫技术和稀土元素免疫标记技术等都大大丰硕和进展了蛋白质连接技术。

更为突出的是在1975年单克隆抗体的研制成功，和化学家们新合成的多种异型双功能交联剂的显现，更将蛋白质连接技术的应用推向新天地。

近些年来，在国内外超级活跃的研究领域——导向药物、免疫毒素相载体释放药物的研究中，亦普遍采纳此类蛋白质连接技术。

如将某种药物(例如抗肿瘤药物)或毒素与载体分子(如单克隆抗体或受体)进行交联组成导向药物，人们誉之为“生物导弹”。

应用这种技术，将抗肿瘤药物(如多诺霉素、丝裂霉素、氨甲蝶蛉等)或毒素(如白喉毒素、蓖麻毒素、红豆毒素等)作为弹头药物与肿瘤单克隆抗体作导向载体所制成的导向药物，对相应肿瘤细胞的杀伤力大大超过一样抗肿瘤药物。

毒素大多都是蛋白质，因此，上述蛋白质连接技术那么可选用于导向药物的制备。

更为可喜的是，近些年来，在分子生物学研究中，专门是在核酸探针的研究与应用中，蛋白质连接技术也大显身手，有人称其为分子生物学的支撑技术。

随着这一技术的应用及其在相关研究领域的不断开拓，蛋白质交联方式也不断改良和渐趋完善，使其在生物医学领域中取得普遍的应用和重视。

目前，蛋白质连接技术不仅普遍应用于人工抗原的合成，而且在小分子物质(如毒物、药物、激素等)和生物大分子的标记免疫分析(放射免疫分析RIA、酶免疫分析EIA、荧光免疫分析FIA、发光免疫分析CIA、时刻分辨免疫分析TrFIA)、标记受体分析(放射受体分析RRA、酶受体分析ERA)及竞争蛋白结合分析等配体结合分析方式中，普遍用作标记配体的制备方式。