核酸分离纯化及鉴定

核酸提取与纯化试剂配方核酸提取和纯化是分子生物学研究中常用的重要步骤。

核酸提取与纯化试剂包括溶解、提取、纯化和测定等步骤。

下面将详细介绍核酸提取与纯化试剂的配方和使用方法。

1. 细胞裂解缓冲液的配方：- 25mM Tris-HCl pH 8.0- 50mM EDTA- 1% SDS- 100μg/ml RNase A将以上试剂按比例混合制备成细胞裂解缓冲液，用于裂解细胞并保护核酸的完整性。

2. 提取缓冲液的配方：- 0.1M Tris-HCl pH 8.0- 0.14M NaCl- 0.001M EDTA- 1% SDS将以上试剂按比例混合制备成提取缓冲液，用于将细胞裂解液中的核酸与蛋白质分离。

3. 过滤缓冲液的配方：- 5M ammonium acetate- 100% isopropanol将5M乙酸铵与等量的100%异丙醇混合制备成过滤缓冲液，用于将核酸从提取液中沉淀。

4. 洗涤缓冲液的配方：- 70% ethanol将绝对乙醇与等量的去离子水混合制备成洗涤缓冲液，用于洗涤核酸沉淀，去除残留的盐类和蛋白质。

5. 纯化缓冲液的配方：- 10mM Tris-HCl pH 8.0- 1mM EDTA将以上试剂按比例混合制备成纯化缓冲液，用于重溶核酸并去除污染物。

使用步骤如下：1. 将待提取的细胞悬浮在细胞裂解缓冲液中，彻底裂解细胞膜。

2. 加入RNase A，在室温下孵育30分钟，酶解RNA。

3. 加入等体积的提取缓冲液，混合均匀后离心，将上清液转移至新离心管，保留上清液，其中含有DNA。

4. 加入等体积的过滤缓冲液，混合均匀后离心，将上清液抽取并丢弃，沉淀中包含核酸。

5. 加入洗涤缓冲液，混合均匀后离心，将上清液抽取并丢弃，重复一次洗涤步骤，确保去除残留的盐类和蛋白质。

6. 倒掉洗涤缓冲液，将离心管倒置在吸水纸上，待离心管底部的液滴完全干燥，避免残留的洗涤缓冲液影响纯化后的核酸。

7. 加入适量的纯化缓冲液，将沉淀重溶，确保核酸的完整性。

《核酸的分离纯化》课件课程目标：1. 理解核酸分离纯化的意义和重要性。

2. 掌握核酸分离纯化的基本原理和步骤。

3. 学习核酸分离纯化的实验操作技巧。

4. 了解核酸分离纯化在科学研究和临床诊断中的应用。

第一部分：核酸分离纯化的意义和重要性1. 核酸的定义和功能核酸是生物体内携带遗传信息的分子，包括DNA和RNA。

核酸在遗传信息的传递、基因表达调控和疾病发生中起着重要作用。

2. 核酸分离纯化的意义核酸分离纯化是研究核酸结构和功能的基础。

核酸分离纯化有助于研究基因表达调控、基因突变和基因功能。

核酸分离纯化在临床诊断和疾病治疗中具有重要意义，如病原体检测、基因突变筛查和个体化治疗。

第二部分：核酸分离纯化的基本原理和步骤1. 核酸分离纯化的基本原理根据核酸的物理化学性质，如大小、电荷、亲和性和稳定性等，进行分离纯化。

常用的分离纯化方法包括离心、电泳、亲和色谱和质谱等。

2. 核酸分离纯化的基本步骤样品处理：收集含有核酸的样品，如细胞裂解、核提取等。

核酸释放：通过机械或化学方法将核酸从样品中释放出来。

核酸沉淀：通过盐析、酒精沉淀等方法将核酸从溶液中沉淀下来。

核酸洗涤：去除沉淀中的杂质，如蛋白、RNA等。

核酸纯化：通过柱层析、亲和色谱等方法进一步纯化核酸。

核酸鉴定：通过紫外线吸收、琼脂糖凝胶电泳等方法检测核酸的质量和数量。

第三部分：核酸分离纯化的实验操作技巧1. 样品处理技巧细胞裂解：使用酶或化学方法裂解细胞，释放核酸。

核提取：使用盐水或缓冲液提取核酸。

2. 核酸沉淀技巧盐析：加入高盐浓度使核酸沉淀。

酒精沉淀：加入酒精使核酸沉淀。

3. 核酸洗涤技巧离心：使用离心机去除沉淀中的杂质。

洗涤缓冲液：选择适当的洗涤缓冲液去除杂质。

4. 核酸纯化技巧柱层析：使用固定相和流动相进行核酸纯化。

亲和色谱：利用核酸与特定配体之间的亲和力进行纯化。

5. 核酸鉴定技巧紫外线吸收：测量核酸在紫外线波段的吸光度。

琼脂糖凝胶电泳：将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，观察核酸的迁移率和条带形状。

➢长期保存样品中可加入1滴氯仿。
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——RNA的保存
➢RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70℃保存 ➢长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ➢在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷 复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
➢ 保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——DNA的保存
➢DNA样品溶于pH8.0的TE缓冲液中，4℃或-20℃保存， -70℃冰箱可保存数年。
➢TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时 DNA易变性
➢分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分 开，同时避免核酸降解。
（三）核酸的分离纯化
应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物
蛋白质、多糖及脂类物质等大分子物质 2.非目的的核酸分子
分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子
核酸分离纯化的基本方法
1.加入浓盐溶液（如NaCl）
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
4.RNA酶（RNAase)抑制剂 （3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside
Complex, VRC)
一、核酸分离、纯化原则
(二)尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度 纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂 或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的 污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如 提DNA分子时，应去除RNA分子。

二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间 的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶 核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物 质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在 40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。


DNA标准曲线的制作和样品测定
管 试 剂 0 对照 DNA标准溶液,ml 0.0 蒸馏水，ml 二苯胺试剂,ml OD595 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 4 1.6 0.4 4.0 5 2.0 0 4.0 号 样品1 2.0 0 4.0 样品2 2.0 0 4.0
动物组织核酸的分离纯化及鉴定
1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验
3. 核酸的定量和纯度测定
核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内， 是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式—— 核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储 存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可 缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等 现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类——核糖核 酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖 或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核 苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖， 一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷 酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴 定。
DNA和RNA的结构
组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。

核酸的分离与纯化


核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
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核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
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5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
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（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。

在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
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为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。

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1.2 核酸分离与纯化的要求
(1) 为保证核酸的完整性，
化学因素？ 生物因素？ 物理因素？
（防止降解），在实验中应注意：
① 尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种 有害因素对核酸的破坏。
② 减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。
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③ 防止核酸的生物降解（细胞内或外的 各种核酸酶水解）。
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除 去，不影响以后实验。
缺点： 需要量大，一般要求低温操作。
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异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA 样品沉淀。一般不需低温长时间放置。
缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥
发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
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使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈
现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物， 例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提 实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
(2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操
作时应戴手套。
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③ 去除对后续实验有影响的物质，如有机 溶剂和过高浓度的金属离子。
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2. 核酸制备的基本步骤
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
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2.1 破碎细胞

实验名称：核酸分离纯化实验实验日期：2023年X月X日实验地点：实验室一、实验目的1. 学习核酸分离纯化的原理和方法。

2. 掌握DNA和RNA的提取、纯化技术。

3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。

二、实验原理核酸分离纯化是指将DNA和RNA从细胞或组织样品中提取出来，并去除其中的蛋白质、多糖、脂类等杂质。

常用的方法有苯酚-氯仿法、柱层析法、磁珠法等。

三、实验材料1. 样品：细胞或组织样品2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、SDS、酚、氯仿、异戊醇、LiCl、无水乙醇等3. 仪器：离心机、移液器、试管、烧杯、磁力搅拌器等四、实验步骤1. 样品处理将细胞或组织样品加入Tris-HCl缓冲液和EDTA，加入SDS，充分混匀，高温处理，使蛋白质变性。

2. 离心将混合液离心，取上清液。

3. 脱蛋白在上清液中加入酚和氯仿，充分混匀，静置，离心。

4. 回收核酸将上层水相转移到新的试管中，加入LiCl，充分混匀，静置，离心。

5. DNA/RNA沉淀将上清液转移到新的试管中，加入无水乙醇，充分混匀，静置，离心。

6. 洗涤弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，离心。

7. 干燥弃去上清液，将沉淀干燥。

8. 溶解将干燥的DNA/RNA沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解。

五、实验结果通过以上步骤，成功提取并纯化了DNA和RNA。

在紫外分光光度计下检测，A260/A280值在1.8-2.0之间，说明DNA/RNA纯度较高。

六、实验讨论1. 实验过程中，样品处理和离心速度对DNA/RNA的提取和纯化有较大影响。

样品处理要充分，离心速度要适中，以确保DNA/RNA的完整性和纯度。

2. 在脱蛋白过程中，酚和氯仿的加入量要适中，过多会影响DNA/RNA的提取和纯化。

3. 在DNA/RNA沉淀过程中，无水乙醇的加入量要适中，过多会导致DNA/RNA沉淀不完全，过少则会影响DNA/RNA的溶解。

4. 实验过程中，要注意实验操作的规范性和无菌操作，以防止DNA/RNA的污染。

核酸提取纯化方法引言核酸提取是分子生物学研究中的一个重要步骤，它主要包括纯化 DNA 和 RNA 两种核酸的过程。

在研究领域，纯化高质量的核酸样品对于准确分析和解读生物信息至关重要。

本文将介绍几种常用的核酸提取纯化方法，包括酚-氯仿法、离心柱法和磁珠法，并对每种方法的优缺点进行评述。

1. 酚-氯仿法酚-氯仿法是一种传统的核酸提取纯化方法，它基于核酸在酚和氯仿两相体系中具有不同溶解度的原理。

具体步骤如下：1.收集待提取的样品，如细菌培养物或组织样品。

2.加入等体积的酚-氯仿溶液，同时加入破碎剂（如玻璃珠或硅胶），彻底混合。

3.离心样品，使得酚相和氯仿相分离。

4.分离上层透明的水相，其中富含 DNA 或 RNA。

5.加入冷异丙醇或乙醇，沉淀核酸。

6.通过离心将沉淀的核酸分离。

7.用缓冲液溶解核酸沉淀，获得纯化后的 DNA 或RNA 样品。

酚-氯仿法提取的核酸样品质量较高，适用于小规模样品的提取。

然而，由于该方法对操作者的技巧要求较高，并且在操作过程中可能存在酚和氯仿对人体的损害风险，所以目前已逐渐被离心柱法和磁珠法取而代之。

2. 离心柱法离心柱法是一种基于硅胶膜和纤维素膜的核酸提取纯化方法，凭借其简单、快速和高效的特点已经成为目前最常用的核酸提取方法之一。

具体步骤如下：1.添加细胞裂解缓冲液到待提取样品中，通过细胞裂解将核酸释放到溶液中。

2.准备离心柱，将离心柱放入收集管中。

3.将样品溶液加到离心柱中，使其通过硅胶膜或纤维素膜。

4.通过洗涤液洗去杂质。

5.加入低盐缓冲液或水，洗脱核酸。

6.将洗脱的核酸收集到新的收集管中。

离心柱法的优点在于简单、快速且对样品的处理量较大，能够同时提取多个样品。

然而，该方法对于某些特殊样品（如富含多酚化合物或多糖的样品）可能会产生一定的干扰。

3. 磁珠法磁珠法是一种新兴的核酸提取纯化方法，它利用了磁珠的磁性和高亲和性，能够快速、高效地提取纯化核酸。

具体步骤如下：1.准备磁珠混悬液，并加入样品。

简述核酸分离纯化的主要步骤核酸分离纯化的主要步骤其实就是一场与基因的“亲密接触”。

我们就像是在进行一场精密的科学“约会”，只不过对象是DNA或RNA，而不是人。

好啦，咱们来看看这个过程如何进行的吧。

1. 材料准备
1.1 样品收集
首先，你得找点样品，可能是植物、动物，甚至是细菌。

想象一下，就像挑选食材一样，你需要挑选新鲜的“原料”。

1.2 细胞裂解
接下来，咱们要“破壳”了！通过加入一些裂解缓冲液，把细胞膜弄开，释放出里面的核酸。

这个过程就像是打开一个“宝箱”，哇，里面可真丰富！
2. 去除杂质
2.1 去除蛋白质
这一步，你得用一些蛋白酶，把细胞里的蛋白质都搞定。

想象一下，就像是把不需要的东西清理出去，只留下最闪亮的宝物。

2.2 沉淀核酸
然后，咱们需要加入酒精，通常是乙醇。

核酸会跟酒精“亲密接触”，沉淀下来。

这个时候你会发现，核酸就像是被请出舞池的主角，闪闪发光！
3. 洗涤与重溶
3.1 洗涤
在沉淀后的核酸上，加点洗涤液，就像给它洗个澡，把残留的杂质都冲走。

你得小心翼翼，别让它“滑了”！。

3.2 重溶
最后一步，是把洗净的核酸重新溶解在缓冲液中。

这个过程就像是给核酸穿上新衣服，焕然一新，准备出门见客！
完成这些步骤后，你的核酸就“出炉”啦！感觉就像是一场成功的约会，满载而归。

希望这个过程能让你对核酸分离纯化有个更轻松的了解。

就这样，你成功地和基因建立了“深厚的友谊”，为后续的实验打下了良好的基础！。

核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。

真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。

DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。

一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。

生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。

所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。

因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。

(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。

(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。

二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。

破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。

机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。

由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。

(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。

这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。

操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。

简述核酸分离纯化的主要步骤。

在生物实验中，核酸分离纯化可谓是一个神奇的过程，像是把“混乱的书房”整理成一间“整洁的书房”，让我们能从一堆杂乱的物质中找出我们需要的那一部分。

要想搞清楚这个过程，我们得从头说起。

先别急，跟我来，我们一块儿来聊聊这些神奇的步骤。

1. 核酸提取的开篇首先，我们得“扒拉扒拉”样品。

也就是说，要从样本里提取出核酸。

这一步就像是把原料放到面粉筛里筛选一样，我们得把细胞破坏开，释放里面的核酸。

这里用的工具有点像“万用刀”，既可以是研磨机，也可以是液氮冷冻破碎机，总之就是要让细胞壁的“防线”彻底崩溃。

像打破冰层一样，把里面的核酸暴露出来。

1.1 细胞破碎：好比“猛兽入笼”细胞破碎的过程，听起来就像是猛兽入笼，猛烈而直接。

为了完成这个步骤，我们可以使用各种各样的试剂，比如说细胞裂解液。

这个液体就像是一把万能钥匙，能把细胞膜一举撬开，释放里面的核酸。

当然，有时候我们也可以用物理手段，比如说搅拌、超声波破碎等，像摇晃沙袋一样，把核酸搞出来。

1.2 去除杂质：清除“杂草”一旦细胞壁被破坏，里面的核酸和其他成分混杂在一起。

接下来，我们要做的就是清除那些“杂草”。

这时候我们会用到一些化学试剂，比如说酚/氯仿混合液。

这些试剂像是高效的“除草剂”，能够把蛋白质和其他杂质从核酸中分离出来。

我们会把样品离心分层，这样就能把核酸分离出来。

记得，离心就像洗衣机的脱水功能，快速旋转让东西分开。

2. 核酸纯化的妙招接下来是核酸纯化的部分了。

这个过程可以说是给核酸做一个“美容”，让它看起来干净又光鲜。

纯化的方式有很多，其中最常用的是柱子纯化。

我们把样品经过特制的柱子，就像是把泥土过滤掉，把精华留下来一样。

柱子的材料有一种特殊的性质，能吸附核酸，而把其他杂质排除在外。

2.1 柱子纯化：像“过滤咖啡”柱子纯化的过程其实就像是过滤咖啡。

你把咖啡粉放到过滤纸里，然后慢慢滴下清水，最终只剩下干净的咖啡液。

类似地，我们把核酸溶液通过柱子，里面的核酸会被柱子吸附，而其他的杂质会被洗掉。

（2）荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%～85%，tRNA及核内小分子RNA占15%～20%，mRNA占1%～5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA与tRNA组成的相对有些扩散的快迁移条带。在真核生物为28S、18S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带（图6-1）。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不见的。通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果，我们可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定在RNA制品中有无DNA的污染。
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。

• 二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化
• （一）质粒DNA的提取 • 基本步骤 • 1.细菌的培养 • 2.细菌的收集与裂解 • 3.质粒DNA的纯化 • 提取方法
• 煮沸法： • 碱法：最常用的质粒DNA提取方法。 • SDS法：
• （二）噬菌体DNA的提取
• 1.细菌培养 • 2.细菌的感染及裂解 • 3.噬菌体的沉淀及纯化 • 4.噬菌体DNA的提取
• 图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
• 图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
一、概述
• 核酸分离提取的原则 • 常用方法及基本原理 • DNA的分离纯化 • RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。

荧光强度 = 碱基长度* 分子个数，（总碱基数越多，插入EB 越多）
琼脂糖凝胶电泳操作注意细节
1） 根据片段大小配制不同浓度的胶（改变分辨率），片段越小， 需要胶浓度越大。 2） 胶要现制先用 3） 选择合适的Marker 4） 配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种，且浓度一致（1倍） 5） 点样时要加入loading buffer，并注意，不要将样点到点样 孔之外（飘样），也不要将胶戳漏（漏样） 6） 根据片段大小及电泳检测目的，选择合适的电压及电泳时间 7）EB染色。
检测原理：
溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中， 在紫外光照射下，发射荧光。
EB: 先染与后染
核酸凝胶电泳技术
溴化乙锭染料的化学结构及 其 对 DNA 分 子 的 插 入 作 用 。 由于插入了溴化乙锭分子， 在紫外光照射下，琼脂糖凝 胶 电 泳 中 DNA 的 条 带 便 呈 现 出荧光，易于鉴定。
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的 能力
凝胶类型及浓度 （bp）
分离DNA的大小范围
0.3%琼脂糖
50 000~1 000
0.7%琼脂糖
20 000~1 000
1.4%琼脂糖
6 000~300
4.0%聚丙烯酰胺
1 000~100
10.0%聚~1
琼脂糖凝胶电泳的原理
rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列， 特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总 RNA纯度和完整性的重要参数。
3、 琼脂糖凝胶电泳
• 3. 1 原理： • 3. 2 用途：
琼脂糖凝胶电泳的原理
DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益
（1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构 型（超螺旋 > 线性 > 开环）； （3） 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成 反比（分子量越大，跑得越慢）；

核酸分离纯化的技术原理核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。

核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。

核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。

在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。

一、液相核酸分离纯化技术（一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。

因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。

核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。

有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。

苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。

蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。

含有DNA样本的水相可通过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。

异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。

其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。

第1篇一、实验目的1. 掌握核酸分离与鉴定的原理和方法。

2. 了解核酸的组成和结构。

3. 学会使用实验仪器和试剂，进行核酸的分离与鉴定。

二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA。

DNA主要存在于细胞核中，负责遗传信息的存储和传递；RNA主要存在于细胞质中，参与蛋白质的合成和调控。

核酸的分离与鉴定是分子生物学研究的基础。

核酸分离与鉴定主要包括以下步骤：1. 核酸提取：利用细胞破碎技术，将细胞内的核酸释放出来。

2. 核酸纯化：去除杂质，得到纯净的核酸。

3. 核酸鉴定：通过物理、化学或生物学方法，鉴定核酸的种类和结构。

本实验以酵母细胞为实验材料，采用碱法提取RNA，并通过紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母细胞2. 试剂：0.04mol/L NaOH溶液、酸性乙醇溶液、琼脂糖凝胶、缓冲液、核酸染料、DNA/RNA Marker等四、实验步骤1. 核酸提取（1）称取1g干酵母细胞，加入2ml 0.04mol/L NaOH溶液，研磨至匀浆状。

（2）加入4ml 0.04mol/L NaOH溶液，混匀，转移至离心管中。

（3）沸水浴加热30min，冷却后离心（2000r/min，15min）。

（4）取上清液，加入等体积的酸性乙醇溶液，混匀，静置2h。

（5）离心（2000r/min，15min），弃去上清液。

（6）加入70%乙醇洗涤沉淀，离心（2000r/min，15min），弃去上清液。

2. 核酸鉴定（1）紫外分光光度法：取适量RNA溶液，在260nm和280nm波长下测定吸光度值，计算RNA浓度。

（2）琼脂糖凝胶电泳：将提取的RNA与DNA/RNA Marker混合，加样至琼脂糖凝胶孔中，电泳（100V，30min）。

观察电泳结果，判断RNA的纯度和完整性。

五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定结果显示，RNA浓度为0.5mg/ml。

2. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，RNA条带清晰，无杂质带，表明RNA纯度和完整性良好。

核酸分离纯化方法引言：核酸分离纯化是分子生物学研究中常用的基础技术之一。

通过分离纯化核酸可以获取高纯度的目标核酸样品，为后续的核酸分析和实验提供可靠的基础。

本文将介绍几种常见的核酸分离纯化方法及其原理、步骤和应用。

一、酚/氯仿法酚/氯仿法是最早用于核酸提取的方法之一，其基本原理是利用酚和氯仿的不同溶解度和密度，将核酸从其他细胞组分中分离出来。

主要步骤包括细胞破碎、酚处理、氯仿处理和酒精沉淀等。

该方法操作简单、成本低廉，适用于从体内或体外样品中提取DNA或RNA。

然而，酚/氯仿法存在操作危险性大、提取效果依赖于操作者经验等问题。

二、硅胶柱层析法硅胶柱层析法是一种常用的核酸纯化方法，利用硅胶吸附核酸的特性实现核酸的分离纯化。

该方法主要包括样品处理、硅胶柱处理和洗脱等步骤。

硅胶柱层析法具有操作简便、纯化效果好、适用于各种核酸样品等优点，广泛应用于基因克隆、PCR扩增和测序等实验中。

然而，硅胶柱层析法的纯化效果受到核酸长度和样品质量的影响。

三、离心管柱法离心管柱法是一种基于离心技术的核酸分离纯化方法，其原理是利用离心管柱中填充的分离介质将核酸与其他杂质分离。

该方法主要包括样品处理、离心管柱处理和洗脱等步骤。

离心管柱法操作简单、纯化效果好、适用于多种核酸样品，被广泛应用于基因克隆、PCR 扩增和测序等领域。

然而，离心管柱法的分离效果受到核酸长度和样品质量的影响。

四、凝胶电泳法凝胶电泳法是一种常用的核酸分离纯化方法，可根据核酸的大小和电荷差异进行分离。

该方法主要包括制备凝胶、样品处理、电泳和染色等步骤。

凝胶电泳法操作简单、成本低廉，适用于从体内或体外样品中分离DNA或RNA。

然而，凝胶电泳法不能提供高纯度的核酸样品，常用于初步分析和检测。

五、商业化试剂盒法随着分子生物学技术的发展，商业化试剂盒法逐渐成为核酸分离纯化的主要选择。

商业化试剂盒包含了多种核酸纯化方法的关键试剂和耗材，操作简便、方便快捷。

根据不同的试剂盒，可以选择合适的纯化方法。