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诱导免疫反应的比较研究

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第23卷　第3期2007年5月 病 毒 学 报CHIN ESE J OU RNAL OF VIROLO GY Vol.23　No.3May 20071型和2型外壳蛋白构建的AAV 载体携带HIV 21ga g诱导免疫反应的比较研究刘红梅1,2#,余双庆2#,冯霞2,刘新蕾2,董小岩1,吴小兵13,曾毅23(11中国疾病预防控制中心　病毒病预防控制所　病毒基因工程国家重点实验室,北京　100052;21传染病预防控制国家重点实验室　病毒病预防控制所　中国疾病预防控制中心,北京　100052)摘要:比较两种血清型的腺病毒伴随病毒(Adeno 2associated virus ,AAV )载体携带HIV 21gag 基因肌肉注射诱导小鼠免疫反应的特点。

分别制备携带EGFP 和HIV 21gag 基因的重组AAV2/1(AAV1)和AAV2载体。

小鼠肌肉注射rAAV12EGFP 和rAAV22EGFP ,观察注射局部EGFP 的表达。

将rAAV12gag 和rAAV22gag 分别以0、3周初免/加强方式肌肉注射免疫BALB/c 小鼠以及新西兰白兔。

EL ISA 法检测抗HIV 21Gag P24蛋白的特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测Gag 特异性的CTL 反应。

结果表明,rAAV12EGFP 在小鼠肌肉的表达强度显著高于rAAV22EGFP ;用Western blot 法和间接免疫荧光法检测rAAV12gag 和rAAV22gag 体外转染的293细胞,均可检测到HIV 21G ag 蛋白的表达;在小鼠体内rAAV12gag 和rAAV22gag 组均可检测到特异性P24抗体,抗体滴度rAAV12gag 组显著高于rAAV22gag 组;而无论rAAV12gag 组还是rAAV22gag 组,特异性CTL 反应均较低,与阴性对照组相比均无显著性差异;两种载体免疫兔子也都可检测到特异性P24抗体,同样地,rAAV12gag 组显著高于rAAV22gag 组。

结论:携带HIV 21gag 基因的rAAV1或rAAV2以肌肉注射方式免疫小鼠主要诱导特异G ag 的体液免疫反应;且rAAV1可诱导很强的抗HIV 21G ag 特异性抗体,抗体水平显著高于rAAV2。

关键词:HIV 21gag;腺病毒伴随病毒;免疫反应中图分类号:R37319;Q78 文献标识码:A 文章编号:100028721(2007)0320177206收稿日期:2006212226;修回日期:2007202208基金项目:中国综合性艾滋病研究项目(CIPRA ,U19AI51915205);国家973课题(2004CB518806)作者简介:刘红梅(19782),女,陕西人,硕士研究生,主要从事分子病毒学和分子免疫学研究。

E 2mail :liuhm2004@gmail 1com通讯作者:吴小兵,E 2mail :wuxb0168@sina 1com#共同第一作者3共同责任作者 目前全球H IV (Human immunodeficiency vi 2rus )感染日益严重,研制有效的HIV 疫苗已成为当今科学界的一个重要任务。

但是由于HIV 的高度变异性以及缺乏合适的动物模型等问题,研制一种安全、有效的HIV 疫苗是人类面临的一项巨大挑战[1]。

一种有效的HIV 疫苗不仅要能诱导产生较强的细胞免疫反应,而且也要能产生有效的体液免疫反应[2],只有这样才能有效地阻止病毒结合以及进入靶细胞,保护免疫的个体。

重组腺相关病毒(rAAV )载体是一种安全有效的基因转移载体,对它的研究已有30多年的历史,目前rAAV2已用于多种人类疾病的基因治疗研究。

AAV 作为载体具有许多优点,如安全性好、宿主范围广、物理性质稳定、易于运输和保存、可长期稳定地表达外源基因等,这些特点使重组AAV 载体用于疫苗研究具有很好的前景[3]。

以AAV 为载体的H IV 疫苗的临床试验在欧洲已经开始进行了。

通常所用的腺相关病毒载体是由血清型2型的AAV 构建的,这种载体的缺点是表达水平低,表达延迟,一般注射后3～4周才达到表达高峰。

有研究表明,近期出现的嵌合载体AAV2/1(AAV1)其转导小鼠骨骼肌的效率明显高于AAV2载体,外源基因的表达水平比AAV2高10倍以上,表达时间也明显提前,在肌注后3天内就可以检测到[427]。

因此设想,用rAAV1介导目的基因可能会诱导高于AAV2的免疫应答水平,可作为一种候选的疫苗载体用于H IV 疫苗的研究。

材料与方法1　菌株、细胞、载体和试剂　工程菌D H5α、H EK293细胞为本室保存。

重组AAV 载体系统由本元正阳基因技术有限公司提供。

FITC 2羊抗兔二抗,HRP 2羊抗兔和羊抗小鼠二抗均购自中杉金桥生物技术有限公司。

脂质体转染试剂Li 2pofectamine TM 2000购自美国Invitrogen 公司。

各种限制性内切酶、T 4DNA 连接酶、Taq 酶及DNA Marker 购自日本Ta KaRa公司。

2　实验动物　雌性BALB/c小鼠,6～8周龄;雄性新西兰白兔,体重约215kg,购自中国医学科学院动物中心。

3　抗原基因优化及多肽合成　HIV21gag基因密码子优化后,全基因合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

G ag特异性多肽P1(1972205):AMQML KETI,P2(2392 247):T TSTL Q EQ I,P3(2912300):EPFRD YVDRF由上海博亚生物技术有限公司合成。

4　质粒构建及病毒包装　以K pnⅠ/S alⅠ为酶切位点将gag插入pSNAV载体,命名为p SNAV2gag。

将pSNAV2 gag质粒稳定转染B H K细胞,用AAVMax TM系统分别包装重组AAV载体。

重组病毒分别命名为rAAV12gag和rAAV22gag。

rAAV12EGFP和rAAV22EGFP购自本元正阳基因技术有限公司。

rAdV52gag为本室保存。

5　rAAV12EG FP和rAAV22EG FP在小鼠体内表达量的比较　10只雌性BALB/c小鼠,6～8周龄,体重约18～25g,随机分为2组,分别为rAAV12EGFP和rAAV22EGFP组,各5只,左下肢胫前肌注射,于0、3周各免疫1次,接种剂量为1×1011vg(viral genome)。

分别于6周、3个月、7个月时将各组小鼠分批处死,取其注射点左下肢胫前肌,紫外灯下观察EGFP的表达。

6　重组病毒中gag基因的表达检测　按6×105和1×105/孔将293细胞分别传入6孔板和24孔板中,37℃5%CO2的孵箱培养过夜。

分别将rAAV12gag和rAAV22gag以MOI=1×105感染293细胞,用未加病毒的293细胞作为阴性对照,同时加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠。

感染后48h收集6孔板中的细胞,用Western blot检测蛋白的表达;24孔板中的293细胞用甲醇固定后,用间接免疫荧光法检测蛋白的表达。

Western blot和间接免疫荧光法中所用一抗为P24多抗(本室保存),二抗分别为HRP和FITC标记的羊抗兔二抗,间接免疫荧光法使用的FITC2羊抗兔二抗用0101%的伊文氏蓝稀释。

7　小鼠免疫　35只雌性BALB/c小鼠,6～8周龄,体重约18～25g,随机分为4组,PBS组、rAAV12gag组和rAAV22 gag组,每组10只,rAdV52gag组5只,左下肢胫前肌注射,于0、3周各免疫1次,rAAV12gag、rAAV22gag组免疫剂量1×1011vg,rAdV52gag组免疫剂量1×107PFU(Plaque forming unit,PFN),体积均为100μl,对照组注射等体积无菌PBS。

分别于1、3、4、6、8、12周采眼底静脉血,分离血清检测其P24特异性Ig G。

8　兔免疫　8只雄性新西兰白兔,体重约215kg,随机分为3组,PBS组2只,rAAV12gag和rAAV22gag每组3只,左下肢肌注免疫,于0、3周各免疫1次,每次接种病毒剂量为1×1012vg,PBS组肌注500μl无菌PBS。

分别于1、2、3、5、6、8、9、10、11、12、14、16周从耳缘静脉采血,分离血清检测其血清中P24特异性Ig G。

9　抗P242IgG检测　以间接EL ISA法测定抗体滴度,纯化的HIV21P24蛋白(本室保存)以碳酸盐包被液稀释至2μg/ mL,每孔100μl包被微孔板,4℃过夜或37℃2h,5%的脱脂奶封闭2h;血清样品用PBA(含10%胎牛血清的PBS),以2倍系列稀释,每孔100μl,PBS免疫组血清为阴性对照,设等体积的PBA作为空白对照,37℃1h,HRP标记的羊抗小鼠或羊抗兔Ig G作为二抗,Bio2Rad550酶标仪在450nm波长下读数,参考波长630nm,结果判定:实验孔OD值-空白孔OD值阴性孔OD值-空白孔OD值≥2判断为阳性,若阴性孔OD值-空白孔OD值<0105,则按0105计算。

10　细胞免疫反应的检测　用细胞内细胞因子染色法检测G ag特异性CTL反应,初次免疫后6周,PBS组、rAAV12 gag组和rAAV22gag组,每组随机挑取5只小鼠,rAdV52 gag组5只,处死,分离脾淋巴细胞,取2×106小鼠淋巴细胞,加入终浓度为10μg/mL G ag特异性多肽P1、P2、P3, 37℃5%CO2培养箱中刺激培养。

同时设立阴性对照孔和阳性对照孔,阴性对照孔不加Gag特异性多肽刺激,其余条件同实验孔;阳性对照孔中也不加多肽,加入终浓度为25ng/mL的佛波酯(PMA)和终浓度为1μg/mL的离子霉素(Ionomycin)刺激。

3h后加入蛋白质运输抑制物布雷非尔德菌素A(Brefeldin A,5μg/mL)处理,继续培养过夜。

PE标记的大鼠抗小鼠CD8a(L y22)单抗室温避光染色1h;4%多聚甲醛室温固定15min;0115%皂素室温穿膜15min;FITC 标记的大鼠抗小鼠IFN2γ单抗室温避光染色1h。

PBA洗涤2次后以1mL PBA重悬,上流式细胞仪,IFN2γ+CD8+的T 细胞占CD8+T细胞的百分比[8]。

结 果1　肌注免疫小鼠EGFP表达量的差异图1　EGFP蛋白在小鼠肌肉中的表达Figure1　The expression of EGFP in muscle of miceA1The photos were taken in light,11,12,13were immunized with rAAV12EGFP,21,22,23were immunized with rAA V22EGFP,yin was the control;B1The photos were taken in ultraviolet ray,11,12, 13were immunized with rAA V12EGFP,21,22,23were immunized with rAAV22EGFP,yin was the control1rAAV12EGFP和rAAV22EGFP肌注免疫组每组3只,在紫外光下可见,7个月时两组小鼠注射点胫前肌仍可观察到明显的绿色荧光,如图1所示,为EGFP蛋白在肌肉中的表达,且rAAV12EGFP 组表达量明显高于rAAV22EGFP组。

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真菌诱导的昆虫免疫反应研究进展

真菌诱导的昆虫免疫反应研究进展

immunity mechanism , model receptors , signal t ransmission , humoral immunit y and cell immunity.
Key words : f ungus ; insect immunity ; pat h of signal t ransmission
不同病原的感染可能引发不同的免疫反应 ,其 机制也有所不同 。最常规的感染是虫体由食物摄入 病原物或受伤的情况下 ,即细菌和病毒进入消化道 或通过伤口引发感染 。目前大部分的研究主要集中 于这种感染引发的昆虫免疫反应 ,并对其机制进行 了深入研究 。然而 ,对于外源性真菌能直接穿透昆 虫表皮进入体内定殖寄生并诱发昆虫免疫反应的相 关报道相对较少 。为此 ,作者就国内外对真菌感染 昆虫的机制以及昆虫对真菌感染的免疫反应方面的 研究进行了综述 ,以期对同类研究提供参考 。
制 、模式受体 、信号转导 、体液免疫 细胞免疫等方面的研究进行综述 。
[ 关键词 ] 真菌 ; 昆虫免疫 ; 信号传导途径
[ 中图分类号 ] S476 + . 12
[ 文献标识码 ] A
Research Progress in Insect Immunit y Respo nse Induced by Fungi
2 血细胞介导的免疫应答
真菌突破昆虫表皮的障碍 ,进入血淋巴后首先 面临的是血细胞的识别和攻击 。对病原菌真菌感染 的细胞免疫主要涉及吞噬 、包囊 、结节等反应[17] 。 已报道的昆虫血细胞有原血细胞 、粒细胞 、珠血细 胞 、浆血细胞及类绛血细胞等 。一般认为主要是浆 细胞和粒细胞在免疫反应中起作用 ,浆细胞是具有 吞噬功能的血细胞 ,粒细胞是具有包囊大分子物质 并去核化形成结节 ,引发酚氧化酶激活产生黑化的 多功能细胞 。
脑膜炎球菌多糖菌苗(A群)的细胞免疫反应机制研究

脑膜炎球菌多糖菌苗(A群)的细胞免疫反应机制研究

脑膜炎球菌多糖菌苗（A群）的细胞免疫反应机制研究脑膜炎球菌（Neisseria meningitidis）是一种引起脑膜炎和败血症的革兰氏阴性菌。

该细菌引起的脑膜炎球菌感染在全球范围内造成严重的公共卫生问题，特别是在儿童和青少年群体中。

为了预防脑膜炎球菌感染，人们研制了脑膜炎球菌多糖菌苗（A群），该疫苗通过激活机体免疫系统来产生有效的免疫保护。

脑膜炎球菌多糖菌苗（A群）主要由脑膜炎球菌的多糖多糖结构组成。

多糖分子是由多个糖基单元连接而成的复杂化合物，它们通常能够诱导机体免疫系统产生免疫应答。

然而，脑膜炎球菌多糖菌苗仅含有多糖结构，缺乏蛋白质的参与。

这种多糖的特性使得它能够通过不依赖T淋巴细胞的机制来诱导免疫反应。

研究表明，脑膜炎球菌多糖菌苗（A群）的细胞免疫反应机制主要与B淋巴细胞和多糖特异性抗体有关。

当多糖结构进入机体后，它们会被被B淋巴细胞的表面免疫球蛋白（B cell receptor, BCR）识别并结合。

这种结合会激活B淋巴细胞，引发细胞内信号转导的级联反应，最终导致B淋巴细胞的增殖和分化。

在B淋巴细胞激活的过程中，T细胞的参与起到了重要的调节作用。

在脑膜炎球菌多糖菌苗（A群）的免疫应答中，T细胞识别和辅助B细胞的活化至关重要。

具体而言，T细胞通过识别多糖与主要组织相容性复合体类II（MHC-II）分子结合后形成的复合物来激活B细胞。

这种T-B细胞合作使B细胞能够更加充分地发挥其免疫功能，促进体内的抗体生成。

除了B细胞的激活和抗体生成外，细胞免疫反应在脑膜炎球菌多糖菌苗（A群）的免疫保护中也起到了重要的作用。

细胞免疫反应主要由专职细胞，如巨噬细胞和树突状细胞等参与。

当多糖结构进入机体后，它们会被这些细胞的受体识别并内化。

这种内化过程会触发一系列的免疫反应，包括产生多种细胞因子、促炎细胞因子和造血因子等。

细胞免疫反应不仅能够直接消灭入侵的脑膜炎球菌，也能够间接地通过调节免疫应答来增强机体的防护能力。

不同疫苗对人群免疫效果的比较研究

不同疫苗对人群免疫效果的比较研究

不同疫苗对人群免疫效果的比较研究第一章前言自新冠疫情爆发以来，全球的关注点都集中在疫苗研发和接种上。

然而，不同类型的疫苗在免疫效果方面可能有很大不同，在接种前需要了解其差异，以便更好地保护公众健康。

本文将对不同类型的疫苗及其免疫效果进行比较研究，以增强公众对疫苗的认知，为日后的疫情防控提供参考。

第二章病毒性疫苗病毒性疫苗是一种以整个活病毒或病毒的部分组分为疫苗株，在人体内通过诱导免疫系统产生特异性抗体来达到预防疾病的机制。

经过多次研究表明，病毒性疫苗在预防传染性疾病方面具有较高的免疫效果。

例如，麻疹疫苗、流感疫苗和黄热疫苗等均属于病毒性疫苗，它们在免疫效果、保护时间和生产成本方面都相对较为优秀。

然而，病毒性疫苗也存在一定的缺点，例如由于疫苗株来源于活病毒或病毒碎片，会对一些人体免疫系统产生过度的反应，从而引起不良反应，如严重过敏，脑炎等。

第三章细菌性疫苗与病毒性疫苗不同，细菌性疫苗采用的是灭菌细胞、分离后的毒素或多糖等，目的是诱导人体产生对特定菌种的保护性抗体。

细菌性疫苗与病毒性疫苗相比，其免疫效果较低，而且保护时间也较短。

例如，百日咳疫苗、脑膜炎疫苗和肺炎球菌疫苗等均为细菌性疫苗，其对疾病的预防效果有限。

此外，细菌性疫苗也存在较大的研发难度，因为细菌种类繁多，免疫机理复杂，因此对细菌性疫苗的研发和推广也存在一定的挑战。

第四章基因工程疫苗基因工程疫苗是一种由重组基因技术制成的疫苗，其常采用病毒载体为疫苗株，经过基因工程技术将目标基因插入载体中，并利用病毒自身繁殖能力快捷地批量制造疫苗。

由于基因工程方法可以轻松地获取多种特定蛋白质，因此该类型疫苗可以很好地诱导人体产生相应蛋白质或抗体，从而达到保护免疫的效果。

目前，新冠疫苗便属于基因工程疫苗。

已经证明，在中国推广的新冠疫苗可在接种后产生强有效的免疫保护，并且在保护时间和成本方面较为优秀。

第五章广谱疫苗广谱疫苗是一种可预防多种疾病的疫苗，与其他类型的疫苗不同，广谱疫苗利用了多种病菌共用的结构或抗原，通过一种疫苗制剂预防和控制多种疾病。

变态反应的原理及其应用研究

变态反应的原理及其应用研究

变态反应的原理及其应用研究变态反应，又称过敏反应，是一种免疫反应异常的现象。

当人体免疫系统对于某种外来物质产生过度的反应，就会出现过敏症状。

这种反应可能会导致轻微的红肿、瘙痒等症状，也可能会引起严重的过敏性休克，甚至威胁生命。

为了更好地理解变态反应的原理及其应用研究，本文将详细介绍相关的知识。

1. 变态反应的原理变态反应是由免疫系统产生的免疫球蛋白（IgE）引起的。

IgE是一种与其他免疫球蛋白不同的分子，它能够与外来物质结合，从而激活机体的免疫反应。

当身体第一次接触到某种外来物质时，如花粉、蛋白质、药物等，免疫系统会产生一种特殊的IgE，称为特异性IgE。

这种IgE会存储在体内的肥大细胞和嗜碱性粒细胞中。

当体内再次接触到同种物质时，这些IgE会与其结合，激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞，释放多种化学物质，如组胺、白三烯等。

这些物质会导致血管扩张、渗出液体、平滑肌收缩等症状，从而引发变态反应。

变态反应的产生是一个复杂的过程，包括敏感化期和反应期两个阶段。

敏感化期是指机体第一次接触到变态原时，在此期间不出现症状，但机体已产生了相应的特异性IgE。

反应期是指再次接触到变态原时，机体通过特异性IgE与变态原结合而产生的急性反应。

2. 变态反应的分类变态反应可以根据症状的轻重和发生的速度分为不同的类型。

常见的变态反应类型包括：（1）即刻型变态反应：一般在接触变态原后30分钟内发生，症状较严重，包括过敏性休克、荨麻疹、呼吸困难等。

（2）迟发型变态反应：发生在变态原接触后6小时以上，但通常需要24-48小时才能出现症状，表现为皮疹、水疱、结痂等。

（3）过敏性细胞浸润型变态反应：主要表现为外周血嗜酸性粒细胞增加、组织细胞浸润、类风湿性关节炎、过敏性鼻炎等。

（4）变态反应性疾病：包括哮喘、荨麻疹、过敏性鼻炎、食物过敏等。

3. 变态反应的应用研究变态反应的应用研究主要包括以下几个方面：（1）变态反应原检测：通过检测特异性IgE或IgG，可以识别出引起变态反应的抗原。