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食品安全风险监测方案根据《2023年食品安全风险监测方案》，结合我县实际，制定本方案。
一、目的收集我县食源性疾病信息和食品中污染物及有害因素污染数据，分析危害因素可能来源，主动发现食品中存在的安全隐患，为开展食品安全风险评估和标准制定、修订及跟踪评价、风险预警和交流、监督管理等提供科学支持。
各相关部门依据各自职责分别承担相应的监测项目。
二、监测内容及范围(-)食源性疾病监测1食源性疾病病例监测报告。
在全县所有开展食源性疾病诊疗的医疗机构(含乡、村级医疗机构)和县疾控中心开展。
监测对象包括食源性疾病疑似病例、确诊病例及聚集性病例。
2.食源性疾病暴发监测报告。
在全县开展。
监测对象为疾控中心依据《食品安全法》第一百零五条开展流行病学调查后确认的，发病在2人及以上或死亡1人及以上的食源性疾病暴发事件。
3.食源性致病菌分子溯源。
在全县开展。
对食源性疾病暴发事件检出的沙门氏菌、致泻大肠埃希氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌等食源性致病菌分离株，食源性疾病主动监测和食品微生物及其致病因子监测的沙门氏菌、致泻大肠埃希氏菌等分离株进行脉冲场凝胶电泳分子分型分析（以下简称“PFGE”）o对食源性疾病暴发事件检出的沙门氏菌、致泻大肠埃希氏菌，食源性疾病专项监测的单核细胞增生李斯特氏菌，食品微生物及其致病因子监测的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌等分离株开展全基因组测序分析（以下简称“WGS"）oPFGE 和WGS由县疾控中心向省疾控中心上送菌株，省疾控中心及具有能力的市级疾控中心开展检测。
4.食源性致病菌耐药性监测。
在全县开展。
监测对象为食源性疾病暴发事件监测、食源性疾病主动监测和食品微生物及其致病因子监测分离出的沙门氏菌、致泻大肠埃希氏菌分离株。
县疾控中心向省疾控中心上送菌株，省疾控中心开展药敏试验。
（二）食品污染、食品有害因素监测对食品中化学性污染物及有害因素、微生物及其致病因子开展常规和专项风险监测。
结合需要适时安排应急风险监测。
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及同源性分析周辉;周万青;张燕;张之烽;沈瀚【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2017(038)022【摘要】目的分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M RS A)感染及耐药情况,为临床提供科学依据.方法收集2015年11-12月本院普外科7例住院患者粪便标本非重复分离的M RS A菌株作为研究对象,回顾性分析患者临床资料,采用全自动微生物分析系统对菌株进行药敏分析,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分析菌株同源性.结果 7例患者均为普通外科术后住院患者,手术前后均不同程度的使用过抗菌药物,尤其是术后均使用过3种或3种以上的抗菌药物;分离的7株M RS A菌株对喹努普汀/达福普汀、利奈唑胺、万古霉素、替加环素、利福平、复方磺胺甲噁唑均敏感,对青霉素、苯唑西林、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、红霉素、克林霉素、四环素均耐药.7株MRSA菌株均来源于同一克隆,其中A1型4株,A2型2株和A3型1株.结论 MRSA感染一般发生于有严重基础疾病且长期使用抗菌药物的住院治疗患者,院内感染是MRSA最主要的传播方式.【总页数】3页(P3162-3164)【作者】周辉;周万青;张燕;张之烽;沈瀚【作者单位】南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏南京210008;南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏南京210008;南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏南京210008;南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏南京210008;南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏南京210008【正文语种】中文【相关文献】1.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因分型和同源性分析 [J], 弓艳娥;刘文恩;简子娟;郭旭霞;李虹玲;李艳明;邹明祥2.烧伤病区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性及同源性分析 [J], 刘文淼;王文;马红;李莎莎;赵梅;李刚3.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表型及基因型同源性分析 [J], 万艳红;葛银林;郝崇华;王淑峰;戎建荣;裴世静4.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同源性分析及耐药性研究 [J], 陆军;祝进;徐礼锋;白永凤;余旭良5.皮肤软组织感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCC mec分型和同源性分析 [J], 汪轩轩;黄颖;胡媛媛;陈鹤;王中新;徐元宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
ＰＦＧＥ在识别和追踪医院感染暴发及流行中的应用文章编号：１００３－８５０７（２００７）１４－２６６０－０３中图分类号：Ｒ１９７．３２３文献标识码：Ａ【综述】乔甫１，康梅２，谭成１，尹维佳１，舒明蓉１，王志芬１关键词：ＰＦＧＥ；医学感染；流行病学调查医院感染是危害医疗安全最重要的原因之一，据美国疾病预防控制中心统计每年约有２００万住院病人发生医院感染，占住院总数的５％￣１０％，同时会导致每年约８８０００人死亡以及带来４５亿美元的经济损失［１］，而近年来随着广谱抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂等药物的广泛使用，各种侵入性诊疗措施的不断增多，由多重耐药菌株引起的医院感染暴发流行时有发生，有学者估计可能为５％［２］。
医院感染暴发及流行一旦发生，如果没有及时、准确的发现暴发的来源，采取积极有效的控制措施，将给病人带来巨大的痛苦，造成无法估计的经济损失以及极坏的社会影响。
因此，迫切需要一种快速、准确、可靠、分辨率高、重复性好的基因分型的方法来识别医院感染的暴发和追踪感染源，以便感染控制人员能及时地切断传播途径，控制感染的流行。
于２０世纪８０年代末发展起来的脉冲场凝胶电泳（Ｐｕｌｓｅｄ－ＦｉｅｌｄＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＦＧＥ）是一种分辨率高、重复性好的基因分型的方法，已广泛用于医院感染暴发的流行病学调查，本文旨在综述ＰＦＧＥ在识别和追踪最常见的医院感染暴发及流行中的应用。
１ＰＦＧＥ的实验原理ＰＦＧＥ是在普通琼脂糖凝胶的基础上演变而成的。
其方法是染色体ＤＮＡ被限制性核苷酸内切酶消化，产生ＤＮＡ大片段，然后用ＰＦＧＥ分离这些大的ＤＮＡ分子片段，因为脉冲电场的方向、时间和电流大小交替改变，当ＤＮＡ分子变换方向的时间小于脉冲周期时，ＤＮＡ就可以按其分子量大小分开，通过比较染色体限制性内切酶图谱，可以确定菌株的亲缘关系。
根据Ｔｅｎｏｖｅｒ等［３］制定的指南，如果分离菌株与暴发菌株之间有０￣３条不同的条带，一般认为菌株是来自于暴发的，有４￣６条不同的条带则认为分离菌株可能是来自暴发，如果两者间有≥７条不同条带则认为分离菌株与暴发流行株之间不存在流行病学关系。
2023金黄色葡萄球菌的抗生素耐药性及其治疗方法感染性疾病是全球人类死亡的第二重要原因；金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种非常常见的人类致病微生物,可引发多种传染病，例如皮肤和软组织感染，心内膜炎，骨髓炎，菌血症和致命性M炎。
此外，根据对抗生素的敏感性，金黄色葡萄球菌可分为对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)和对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSAi近几十年来，由于细菌的进化和抗生素的滥用，金黄色葡萄球菌的耐药性在世界范围内，MRSA的感染已逐渐增加，MRSA的感染率也在增加，并且针对MRSA的临床抗感染治疗变得更加困难。
越来越多的证据表明，金黄色葡萄球菌的耐药机制非常复杂,尤其是对于对多种抗生素具有耐药性的MRSA o因此,及时了解MRSA的耐药性并从分子水平阐明其耐药机制对于金黄色葡萄球菌感染的治疗具有重要意义。
大量研究人员认为，对金黄色葡萄球菌的分子特征进行分析，可以为设计有效的预防和治疗措施引起的医院感染提供基础。
金黄色葡萄球菌进一步演变金黄色葡萄球菌。
本文综述了MSSA和MRSA的研究现状，内在抗药性和获得性抗药性的详细机制，抗MRSA 抗生素的先进研究以及新型的MRSA治疗策略。
金黄色葡萄球菌(S.aureus谩医院和社区感染的主要病原体之一,可引起许多传染病,例如轻度皮肤和软组织感染，感染性心内膜炎，骨髓炎，菌血症和致命性肺炎。
金黄色葡萄球菌于1880年由外科医生亚历山大•奥格斯顿(A1exanderOgston)从溃疡疮患者中首次发现。
金黄色葡萄球菌属于金黄色葡萄球菌类。
革兰氏染色阳性，直径约0.8μm,需氧或厌氧显微镜下排列在〃一串葡萄〃中；并在37℃和pH7.4下最佳生长。
血琼脂平板上的菌落厚而有光泽，呈圆形,直径为1〜2mm o它们大多数是溶血的，在血琼脂平板上的菌落周围形成透明的溶血环。
此外，金黄色葡萄球菌不形成泡子或鞭毛,但具有胶囊,可以产生金黄色颜料并分解甘露醇。
PFGE 及其在细菌流行病学研究中的应用PFGE（Pulse-field gel electrophoresis）是一种分子生物学技术，主要用于快速和高效地分析细菌菌株之间的差异，是细菌的指纹技术。
PFGE主要是通过对细菌DNA的切割和电泳来测定不同菌株之间的遗传变异，它可以识别出细菌所拥有的DNA序列和大小的差异。
PFGE技术的引入，让对于细菌传播以及精细疫学研究这类问题的探究得以更为有效和准确地进行，也更促进了对于致病性菌株的分析和监测。
PFGE技术的优势在于其能够区分被测细菌的各个部位或其DNA序列的细微变化，并且对于一些临床样本中含有大量细菌的复杂混合菌群的分析也能够较好地处理。
PFGE可以来自于不同地理区域和不同来源的细菌进行比较，找到疾病来源和传播路径，从而确定一些疾病的传播途径和病毒的来源，对于疫情监测和全球传染病控制也具有重要意义。
PFGE被广泛用于胆囊炎弧菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、分枝杆菌、支原体、沙门菌和克雷伯菌等病原体的病原学研究和卫生防疫工作中。
举个例子来说，2008年中国北京地区发生了一起由大肠杆菌O157:H7引起的食物中毒事件。
通过PFGE技术的分析，发现不同地点的患者来源明显不同，而在同一家食品公司拥有的多个分店之间没有发现菌株的相同性，可以证明病原物源头是通过不同路线传播进入人体的。
又例如在美国，美国疾病预防控制中心（CDC）在分离与海洋及岸边相关的分支杆菌中发现了菌株的异质性，通过PFGE技术的研究，可以追踪到这些菌株的来源，从而增进了对于流行病的认识。
PFGE技术虽然具有许多优点，但是相较于其他技术，如全基因组测序（WGS）等，同时还存在着一些局限性，所以在实际应用中需要注意。
PFGE技术进行的基本问题就在于如何设计合适的限制酶以解剖DNA，切割后的DNA需要经电解质处理进行电泳分离，需要使用嵌入式电场或外加电场来推动DNA的运移，同时还要经过染色、照相。
金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序
1.菌悬液的制备
1）在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，
分别加入约1-2mlCSB缓冲液。
2）在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称。
3）用棉棒从培养皿上刮取适量细菌，悬浊于CSB中，用eppendorf分光光度计测其OD值，调整至5.5～6.5之间。
注：如果样品数量多，调完OD后先存放于4℃。
4）取250µl菌悬液于相应的1.5ml eppendorf管中。
5）加入2µl溶葡萄球菌酶（1mg/ml），用移液枪充分吹打。
不需振荡摇匀。
2.胶块的制备
1）准备10ml的1% SKG（称取0.1g SKG溶于TE，用微波炉加热至完全溶解，放在53℃～56℃水浴中）。
2）取250µl预热（53℃～56℃）的SKG，与250µl菌悬液混合，用移液枪轻轻吹打5次左右至液体混匀，避免产生气泡。
混合前菌悬液可在水浴里预热10秒，并摇匀。
3）将混合物立即加入模具，避免产生气泡，在室温下凝固10～15分钟或置于4℃冰箱5分钟。
3.细胞的裂解
1）在50ml的screw-cap tube上做好标记。
2）配制细胞裂解液（CLB），参见表1。
蛋白酶K原液须放在冰上或冰盒里。
表 1
样本数量CLB 蛋白酶K（20mg/ml）
1 4ml 30µl
10 40 ml 300µl
3）每个管子加入4ml蛋白酶K/CLB混合液。
保证胶块在液面下而不在管壁上。
4）将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。
5）将纯水和TE放在54℃水浴中预热。
4.洗胶块
1）从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap，轻轻倒掉CLB。
2）每管中加入15ml预热的纯水。
确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回54℃水浴摇床中，摇15分钟。
3）倒掉水，加入15ml预热的TE，在54℃的水浴摇床中重复洗3次，时间分别为15分钟，15分钟，30分钟。
4）倒掉TE，加入5ml TE，放在4℃冰箱保存备用。
第二天
5.胶块内DNA的酶切
1）准备30℃和37℃水浴。
在1.5ml eppendorf管上标记好相应样品的名称。
2）按照表2，配制SmaI的稀释缓冲液，混匀。
注意：须带手套操作，缓冲液和BSA置于冰上。
表2
试剂（Takara）µl/胶块µl /7胶块µl /12胶块
纯水160µl1120µl1920µl
10×T Buffer 20µl140µl240µl
BSA（0.1％）20 140 240
总体积200µl1400µl2400µl
3）按照表3，配置XbaI的稀释缓冲液。
注意：须带手套操作，缓冲液和BSA 置于冰上。
表3
试剂（Promega）µl/胶块µl /3胶块
纯水178µl534µl
Buffer D 20µl60µl
BSA（10mg/ml） 2 6
总体积200µl600µl
4）在每个1.5ml eppendorf管中加入200µl稀释缓冲液。
5）用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。
确保胶块在液面下面。
将剩余的胶块放回原来的TE中。
6）用同样的方法处理标准株H9812的胶块，放入XbaI缓冲液中。
7）将XbaI管子放在37℃水浴中，SmaI管子放在30℃水浴中孵育10-15分钟。
8）在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。
表4
试剂（Takara）µl/胶块µl /7胶块µl /12胶块
纯水155µl1085µl1860µl
10×T Buffer 20µl140µl240µl
BSA（0.1％）20 140 240
SmaI 5 35 60
总体积200µl1400µl2400µl
表5
试剂（Promega）µl/胶块µl /3胶块
纯水173µl519µl
Buffer D 20µl60µl
BSA（10mg/ml） 2 6
XbaI 5 15
总体积200µl600µl
9）孵育完，用移液枪吸出液体，吸液时枪头应贴到管底，注意避免破坏胶块。
10）每管加入200µl内切酶混合液，确保胶块在液面的下面。
11）将XbaI管子放在37℃，SmaI管子放在30℃水浴中孵育3～4小时。
6.制备1％胶
1）称取1g SKG，溶于100ml 0.5×TBE缓冲液中。
15孔模具需配制150ml体积的胶。
2）微波炉加热约2分钟，每20妙混匀，直至完全溶解。
3）放在53℃～56℃水浴，5～6分钟。
7.加样
1）调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。
用水平仪调整胶槽使其水平。
2）从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。
用枪头吸出酶切混合液，枪头应贴至管底，避免损伤或吸出胶块。
3）每管加入200µl 0.5×TBE，用枪头冲洗胶块。
4）把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。
如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上，若为15个齿的梳子则放在第1、5、10、15个齿上。
5）把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。
从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在53℃～56℃平衡的1％SKG。
避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。
在室温下凝固30分钟左右。
8.电泳：设置电泳参数。
大、小胶均用此参数。
Initial switch time = 4.0 seconds
Final switch time = 40.0 seconds
14cm宽×13cm长的胶电泳时间为19小时
启动“Start Run”
第三天
9.图像的获取
1）取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml，1：
10,000稀释，即在400ml水中加入40µl储存液），摇30分钟。
注意：EB是致畸剂。
储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用5次。
废弃的EB溶液
应妥善处理。
2）用纯水冲洗胶即可读取图象。
3）电泳图像通常用BIO-RAD的GEL DOC 2000或其它成像系统来获取。
图像
需为IBM兼容的未压缩的TIFF格式，且分辨力≥768 x 640像素。
10.PFGE图谱分析例图
1，8，15 为marker; 2-B18323;
3-R1829; 4-135; 5-164;6-182;
7-R1482; 9-R1544; 10-R2523;
11-R2788;12-R3685; 3-W1396;
14-W1563。
